7 第七章 电子显微镜免疫组织化学技术
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③ 固定剂的pH；
④ 固定剂的温度,一般采用2℃～4℃冷固定；这样能降低细 胞自溶作用和水分抽提；
⑤ 固定时间与温度有关，温度高，固定快，也与缓冲系的 离子强度有关，离子强度大，渗透压大，穿透力强，固定要 快。不同的固定剂，或同一固定剂的不同浓度所需的固定时 间也不一致； ⑥ 与被固定的细胞类型有关。
4) 包埋聚合： 组织移入盛满包埋液的胶囊内，放在真空泵内以去除包 埋液中的气泡，然后在4℃，以紫外线灯(波长360nm)在距 胶囊底部10～20cm处进行照射12～16h，以手指捏胶囊试其 硬度可知聚合是否完成。在聚合完成后，将胶囊丢人热水中 以去除胶囊外壳。
5) 包埋后染色:切片贴在镍网上，按胶体金标记蛋白A技术（PAg 法）进行包埋后染色，铀、铅双染后，电镜观察。
改进方法： 增加一定比例的增塑剂如甲基丙烯酸丁脂和水、聚乙二醇 400改变其硬度。使之变软；
加入适量的交联剂乙烯二甲基丙烯酸酯以增强其抗电子束 轰击的稳定性。
选用低温型引发剂—过氧化苯甲酰避免聚合时过快，产生 高温，损伤组织结构。
GMA已广泛应用于半薄切片(1～3 um)的光镜观察，特别是 组织化学方面的研究和电镜水平的免疫细胞化学技术。
包埋前染色法的优点是：
① 切片染色前不经固定、脱水及包埋等过程，不破坏抗原。 ② 在免疫反应阳性部位定位作超薄切片，提高电镜下的检 出率。适用含抗原量较少的组织。
2 包埋后染色（载网染色）
组织标本经过固定、脱水及树脂包埋、制成超薄切片； 免疫组化染色（载网染色）
注意事项： ① 四氧化锇具有保存抗原的作用，但应用四氧化锇可使抗 原活性明显减低。后固定中一般以不用四氧化锇为佳，或尽 量缩短在四氧化锇中停留的时间。 ② 在载网染色过程中，铜网易与化学物质产生反应，故需选 用镍网或金网。 ③ 在免疫组化处理的全过程中，应注意保持网面的湿润，网 面干燥会影响抗体活性。
优点：铁蛋白易从马脾中获得，呈颗粒状，易分辨； 缺点：分子量较大，不易穿透细胞膜和组织，对于细胞
内抗原的定位较困难。只适合电镜检查，不能用普通光学显微镜观察。 因此，在近年来逐渐被免疫酶和胶体金取代。
2 电镜标本的制备
（1）固定
同常规电镜（醛类和四氧化锇双固定） 铁蛋白标记抗体分子量大，如用于细胞表面抗原的定位研究，
（3）GMA（乙二醇甲基丙烯酸酯）
优点： ① 电子密度大；② 影像反差好。 缺点： ① 包埋聚合后的组织块很脆，不易修整和切片。 ② 聚合过程中易造成组织损伤如人为的细胞器肿胀。 ③ 缺乏稳定性，不能承受电子束轰击，包埋剂遇热升 华，造成组织塌陷变形。故后来为环氧树脂所取代。 环氧树脂： 有良好的塑料稳定性，能承受电子束的轰击不变形； 影像反差好，分辨率高； 半薄切片染色不够满意，效果不如GMA包埋切片的染色效果。
新鲜K4M臵于胶囊内，将组织块移入，在-30℃～-40℃以紫外线灯照射 24h使之聚合。如为100W灯泡，照射距离应大于85 cm。聚合后的胶囊移
至室温在紫外线下继续照射2～3天，可增加其硬度，便于切片。
3) 免疫染色
① ② ③ ④ ⑤ 切片贴在金网或覆有碳膜的镍网上； 正常羊血清30 min； 稀释一抗，37℃2h； 可用烧杯法(或塑料壶喷洗法)，以镊夹镍网在烧杯中洗荡； 正常羊血清30min。
（2）LR white和LR gold
是一种混合的丙烯酸单体的透明树脂； 具有极低粘度和较强嗜水性，穿透性强，有利于抗体(或抗原) 和免疫化学物质穿过LR树脂，达到组织结合部位； 在免疫细胞化学的光镜(半薄切片)和电镜水平应用都具有良好 效果。 标本脱水至70％乙醇即可，能较好地保持抗原性。 生物样品处理与免疫染色等同常规树脂切片。
▲ 低温包埋剂常用于铁蛋白或胶体金免疫电镜技术的 包埋后染色。能检出应用环氧树脂包埋难以检出的 多种抗原。
（四）对照试验: 略
免疫电镜技术存在的问题：
▲ 戊二醛、锇酸等固定液有利于微细结构的保存，但对抗原活
性有影响；
▲ H202能增加树脂穿透性，但对微细结构有损伤，能使反应部
位产生孔洞。
▲ 染色中清洗工作不彻底，可产生非特异性产物和其他污染
b．A液：
GMA单体液 90ml PFG z300 5 ～9.4 ml 过氧化苯甲酰 0.2～0.69 g 搅拌溶解后臵棕色瓶内；4℃保存。 B液： PEG z400 20 ml 二甲基苯胺 1 ml 应用时A：B按10：1比例充分混。
3) 生物样品处理： 组织固定可用PLP液或1％戊二醛溶液(磷酸缓冲液配制， Ph7.4)。经系列酒精脱水至新鲜的GMA单体溶液中浸24h。 以上步骤可在室温或4℃进行。
在细胞质的空泡内可见到大量的与细胞 艾滋病患者血清的免疫电镜所见。 在病毒颗粒表面可见铁蛋白颗粒的吸附。 外所见相同的病毒颗粒。
培养的成纤维细胞质膜对LDL的内吞作用 LDL颗粒与含铁的转铁蛋白共价相连， 电子显微镜下所见的黑点是小分子 的铁。（a）LDL与细胞表面的受体结合并形成有网格蛋白包被的小窝；（b） 含有LDL的被膜小窝向下凹陷逐渐形成被膜小泡；（c） 含有转铁蛋白标记的 LDL被膜小泡；（d）含有转铁蛋白标记的LDL颗粒的无被小泡（初级内体）。
（2） 免疫染色方法
常采用包埋前免疫染色，分为直接法和间接法。 （1）直接法：
切片直接浸于标记的特异性抗体内，室温或37℃1～2h以上； 缓冲液浸漂，除去未结合的标记抗体溶液； 再按常规电镜后固定、脱水、包埋。
（2）间接法：
将切片浸入一抗室温孵育30～60min； 大量冷缓冲液充分洗涤(3×30min)； 浸入铁蛋白标记二抗中，室温孵育30min； 充分洗涤后，可以自然沉淀或用离心方法捞取组织片； 将离心沉淀小块，用四氧化锇固定30分钟； 常规电镜脱水、包埋、切片、染色和观察。
⑥ 二抗以正常羊血清稀释，以镍网臵于血清滴上孵育。
⑦ 冲洗如④。 ⑧ 覆于2％OsO4水溶液上，30min。 ⑨ 冲洗如④。 ⑩ 干燥后在电镜下观察。 注意事项：所有步骤在室温、湿盒内进行；所有溶液需经微孔滤纸滤过。 Lowicryls 应保存在暗处，一4℃，该物质有刺激性，在配制时应戴手套， 以免触及皮肤。在通风橱内操作，以免蒸汽刺激眼睛。如触及皮肤和眼睛， 应立即以水冲洗局部。
可将样品直接放入固定液；细胞内抗原测定需：
冻融法：固定后冻融使细胞膜破裂，标记抗体能进入细胞内。
冰冻切片法：固定后速冻，切成10-15um薄片，融化的切片直接 浸泡于铁蛋白标记的抗体液中。
戊二醛固定后，浸入洋地黄皂甙液中1-2min，增强细胞膜穿透性， 使标记抗体进入细胞内
冰冻超薄切片铁蛋白标记抗体免疫电镜图
特点：
是能在低温下保持低粘度； 具有在光照射下聚合的能力，光聚合作用与温度无关。
K4M和K11M具有亲水性，能较好地保持组织结构和抗原性，减少背景染色； HM20和HM23具疏水性，能产生高反差图像，适用于扫描、透射电镜和暗视 野观察切片的制作。 K4M应用较多
K4M 的应用
1）包埋剂的配制： 由三个部分组成：单体，交联剂和引发剂。 调整单体、交联剂比例，增加交联剂，可增加组织块的硬度。 中等硬度的组织块，其配制比例如下： K4M：单 体 17.30g 交联剂 2.70g 引发剂 0.10g
可用微量注射器加针头抽取后，注入棕色玻璃容器避光，用 玻棒轻搅3—5 min或用一小管通入液氮气泡搅拌。勿过分搅拌， 以防氧的气泡进入包埋剂中。
2) 生物样品处理程序
① 取材，以多聚甲醛一赖氨酸—过碘酸钠固定；
② 含7％蔗糖PBS，冲洗过夜； ③ 0.1 mol／LPBS， pH 7.2冲洗； ④ 系列脱水； ⑤ 包埋：
去除四氧化锇：
免疫染色前，将载网超薄切片以H202液蚀刻数分钟，以去锇和 增强树脂的穿透性。
3 超薄冰冻切片
将组织臵于蔗糖保护液中，以液氮速冻； 在冰冻超薄切片机上切片； 免疫染色。
不需经固定、脱水、包埋等步骤，所以抗原性保存 较好，兼有包埋前和包埋后染色的优点。但技术条 件要求较高、难度较大。
（一）组织固定与取材
原则： 固定： 固定剂的要求： ①不损害细胞内抗原的活性； ②固定速度快、效果好；
既要保存良好的细胞超微结构，又要注意保持组织的抗原性。
③分子量小，易于渗透；
④固定后,不引起交联，造成空间的阻碍，影响标记抗体进入 抗原位。
影响固定的因素有：
① 固定剂的种类；
② 固定剂的浓度，浓度过大，对抗原的活性有影响，浓度 过小，固定效果差；
取材：免疫电镜技术较光镜免疫化学技术要求更迅速、精细。
（二）免疫染色
包埋前染色 包埋后染色 超薄切片免疫染色
1 包埋前染色
即先行免疫染色，在解剖显微镜下将免疫反应阳性部位取 出，修块；常规电镜方法处理，经锇酸固定、脱水、树脂包
埋。
特异性免疫反应的范围太小，可作二次包埋：
即第一次包埋时将组织臵于两层塑料片之间，中夹环氧树 脂如夹心面包式，进行高温聚合，然后在解剖显微镜下取出
物，影响特异性反应产物的显示和观察。
二、几种常用的透射电镜方法要点
（一）铁蛋白标记免疫电镜技术
（二）过氧化物酶标记免疫电镜技术
（三）胶体金标记免疫电镜技术 （四）凝集素标记免疫电镜技术
（一）铁蛋白标记免疫电镜技术
1 原理
铁蛋白：是一种含铁约占23％的蛋白质，铁蛋白含有致密的铁离子核
心，含2000～3000个铁原子，分布于四个区域，形成四个圆形致密 区，具有很高的电子密度，便于电镜观察。 抗体与铁蛋白通过双功能试剂结合为一种双分子复合物。 此复合物保留了抗体的免疫活性，通过电镜可定位抗原。适于细胞表面 抗原的定位
优点：
超微结构保存较好，方法简便，阳性结果有高度的可重复性， 还能在同一超薄切片上进行多重免疫染色。
缺点：
抗原活性在样品处理过程中可能减弱甚至丧失； 环氧树脂中可与组织成份发生反应而改变抗原性质； 包埋在环氧树脂中的组织不易进行免疫反应等。
解决对策： 去除包埋剂：
饱和苯溶液，无水酒精中NaOH饱和溶液或乙氧化钠溶液等。
GMA包埋剂的配制、生物样品处理和电镜水平的免 疫细胞化学染色方法：
1) 过滤: GMA单体溶液在出厂时都加有氢醌类稳定剂，用前须 以每25ml单体溶液加一匙活性碳，在振荡器上振荡5 min，过 滤以除去氢酯，以免影响聚合。 2) 包埋剂的配制： a. 100％GMA N-甲基丙烯酸丁酯 66.5ml 5％乙烯二甲丙烯酸酯 28.5ml 1.5％过氧化苯甲酰 1.0g 1.0％PEG 400 1.0ml
（三）包埋
树脂包埋、低温包埋
1 树脂包埋 环氧树脂包埋法 直接脱水后包埋 原位包埋：将小片组织或半薄切片贴在载片上， 将充满环氧树脂的明胶囊倒臵
于切片上聚合、硬化，进行包埋。
2 低温包埋
低温包埋剂：
（1Leabharlann BaiduLowicryls：
是丙烯酸盐和甲基丙烯酸盐化学物质，包括K4M、HM20、K1lM、KM23等系列 产品。
选用固定剂不宜过强。常采用灌注固定法。 多聚甲醛—戊二醛混合液 过碘酸—赖氨酸一多聚甲醛液(PLP液)： 对含糖类丰富的组织固定效果特佳。 （使用前必须用已知效价的抗原做一系列预实验。如固定剂的 种类浓度、温度、pH及固定时间等。然后做出预处理的效价， 作为失活参考以再选择最适条件。）
灌流后需续固定：四氧化锇
（二）过氧化物酶标记免疫电镜技术
1 原理：利用酶作为抗原抗体复合物的标记物，再经酶对底物作用生成
需要部位作第二次包埋。
包埋前染色的组织，以中层较为理想。
半薄切片可在相差显微镜下不染色观察（PAP），免疫反应部位呈黑点状； HE或甲苯胺蓝染色的半薄切片上，免疫反应部位呈棕黄色。
表层因受机械修整，结构保存不好，深层因抗体不能透入，免疫反应弱或无。
取相连续的超薄切片
为避免电镜铅、铀染色反应与免疫反应之间的混淆，分别以两个铜网捞取， 其中之一进行染色观察，另一以铀单染色或不染色进行对照观察。
第七章
免疫电镜
一 电镜免疫组织化学技术概述
二 几种常用的透射电镜方法要点
一 电镜免疫组织化学技术概述
特异性抗体用电子致密物质，如铁蛋白、胶体金等标记后， 使之与组织超薄切片中的抗原结合，在电镜下观察到标记物所
在位臵，即为抗原抗体反应的部位。
（一）组织固定与取材 （二）免疫染色 （三）包埋 （四）对照试验
④ 固定剂的温度,一般采用2℃～4℃冷固定；这样能降低细 胞自溶作用和水分抽提；
⑤ 固定时间与温度有关，温度高，固定快，也与缓冲系的 离子强度有关，离子强度大，渗透压大，穿透力强，固定要 快。不同的固定剂，或同一固定剂的不同浓度所需的固定时 间也不一致； ⑥ 与被固定的细胞类型有关。
4) 包埋聚合： 组织移入盛满包埋液的胶囊内，放在真空泵内以去除包 埋液中的气泡，然后在4℃，以紫外线灯(波长360nm)在距 胶囊底部10～20cm处进行照射12～16h，以手指捏胶囊试其 硬度可知聚合是否完成。在聚合完成后，将胶囊丢人热水中 以去除胶囊外壳。
5) 包埋后染色:切片贴在镍网上，按胶体金标记蛋白A技术（PAg 法）进行包埋后染色，铀、铅双染后，电镜观察。
改进方法： 增加一定比例的增塑剂如甲基丙烯酸丁脂和水、聚乙二醇 400改变其硬度。使之变软；
加入适量的交联剂乙烯二甲基丙烯酸酯以增强其抗电子束 轰击的稳定性。
选用低温型引发剂—过氧化苯甲酰避免聚合时过快，产生 高温，损伤组织结构。
GMA已广泛应用于半薄切片(1～3 um)的光镜观察，特别是 组织化学方面的研究和电镜水平的免疫细胞化学技术。
包埋前染色法的优点是：
① 切片染色前不经固定、脱水及包埋等过程，不破坏抗原。 ② 在免疫反应阳性部位定位作超薄切片，提高电镜下的检 出率。适用含抗原量较少的组织。
2 包埋后染色（载网染色）
组织标本经过固定、脱水及树脂包埋、制成超薄切片； 免疫组化染色（载网染色）
注意事项： ① 四氧化锇具有保存抗原的作用，但应用四氧化锇可使抗 原活性明显减低。后固定中一般以不用四氧化锇为佳，或尽 量缩短在四氧化锇中停留的时间。 ② 在载网染色过程中，铜网易与化学物质产生反应，故需选 用镍网或金网。 ③ 在免疫组化处理的全过程中，应注意保持网面的湿润，网 面干燥会影响抗体活性。
优点：铁蛋白易从马脾中获得，呈颗粒状，易分辨； 缺点：分子量较大，不易穿透细胞膜和组织，对于细胞
内抗原的定位较困难。只适合电镜检查，不能用普通光学显微镜观察。 因此，在近年来逐渐被免疫酶和胶体金取代。
2 电镜标本的制备
（1）固定
同常规电镜（醛类和四氧化锇双固定） 铁蛋白标记抗体分子量大，如用于细胞表面抗原的定位研究，
（3）GMA（乙二醇甲基丙烯酸酯）
优点： ① 电子密度大；② 影像反差好。 缺点： ① 包埋聚合后的组织块很脆，不易修整和切片。 ② 聚合过程中易造成组织损伤如人为的细胞器肿胀。 ③ 缺乏稳定性，不能承受电子束轰击，包埋剂遇热升 华，造成组织塌陷变形。故后来为环氧树脂所取代。 环氧树脂： 有良好的塑料稳定性，能承受电子束的轰击不变形； 影像反差好，分辨率高； 半薄切片染色不够满意，效果不如GMA包埋切片的染色效果。
新鲜K4M臵于胶囊内，将组织块移入，在-30℃～-40℃以紫外线灯照射 24h使之聚合。如为100W灯泡，照射距离应大于85 cm。聚合后的胶囊移
至室温在紫外线下继续照射2～3天，可增加其硬度，便于切片。
3) 免疫染色
① ② ③ ④ ⑤ 切片贴在金网或覆有碳膜的镍网上； 正常羊血清30 min； 稀释一抗，37℃2h； 可用烧杯法(或塑料壶喷洗法)，以镊夹镍网在烧杯中洗荡； 正常羊血清30min。
（2）LR white和LR gold
是一种混合的丙烯酸单体的透明树脂； 具有极低粘度和较强嗜水性，穿透性强，有利于抗体(或抗原) 和免疫化学物质穿过LR树脂，达到组织结合部位； 在免疫细胞化学的光镜(半薄切片)和电镜水平应用都具有良好 效果。 标本脱水至70％乙醇即可，能较好地保持抗原性。 生物样品处理与免疫染色等同常规树脂切片。
▲ 低温包埋剂常用于铁蛋白或胶体金免疫电镜技术的 包埋后染色。能检出应用环氧树脂包埋难以检出的 多种抗原。
（四）对照试验: 略
免疫电镜技术存在的问题：
▲ 戊二醛、锇酸等固定液有利于微细结构的保存，但对抗原活
性有影响；
▲ H202能增加树脂穿透性，但对微细结构有损伤，能使反应部
位产生孔洞。
▲ 染色中清洗工作不彻底，可产生非特异性产物和其他污染
b．A液：
GMA单体液 90ml PFG z300 5 ～9.4 ml 过氧化苯甲酰 0.2～0.69 g 搅拌溶解后臵棕色瓶内；4℃保存。 B液： PEG z400 20 ml 二甲基苯胺 1 ml 应用时A：B按10：1比例充分混。
3) 生物样品处理： 组织固定可用PLP液或1％戊二醛溶液(磷酸缓冲液配制， Ph7.4)。经系列酒精脱水至新鲜的GMA单体溶液中浸24h。 以上步骤可在室温或4℃进行。
在细胞质的空泡内可见到大量的与细胞 艾滋病患者血清的免疫电镜所见。 在病毒颗粒表面可见铁蛋白颗粒的吸附。 外所见相同的病毒颗粒。
培养的成纤维细胞质膜对LDL的内吞作用 LDL颗粒与含铁的转铁蛋白共价相连， 电子显微镜下所见的黑点是小分子 的铁。（a）LDL与细胞表面的受体结合并形成有网格蛋白包被的小窝；（b） 含有LDL的被膜小窝向下凹陷逐渐形成被膜小泡；（c） 含有转铁蛋白标记的 LDL被膜小泡；（d）含有转铁蛋白标记的LDL颗粒的无被小泡（初级内体）。
（2） 免疫染色方法
常采用包埋前免疫染色，分为直接法和间接法。 （1）直接法：
切片直接浸于标记的特异性抗体内，室温或37℃1～2h以上； 缓冲液浸漂，除去未结合的标记抗体溶液； 再按常规电镜后固定、脱水、包埋。
（2）间接法：
将切片浸入一抗室温孵育30～60min； 大量冷缓冲液充分洗涤(3×30min)； 浸入铁蛋白标记二抗中，室温孵育30min； 充分洗涤后，可以自然沉淀或用离心方法捞取组织片； 将离心沉淀小块，用四氧化锇固定30分钟； 常规电镜脱水、包埋、切片、染色和观察。
⑥ 二抗以正常羊血清稀释，以镍网臵于血清滴上孵育。
⑦ 冲洗如④。 ⑧ 覆于2％OsO4水溶液上，30min。 ⑨ 冲洗如④。 ⑩ 干燥后在电镜下观察。 注意事项：所有步骤在室温、湿盒内进行；所有溶液需经微孔滤纸滤过。 Lowicryls 应保存在暗处，一4℃，该物质有刺激性，在配制时应戴手套， 以免触及皮肤。在通风橱内操作，以免蒸汽刺激眼睛。如触及皮肤和眼睛， 应立即以水冲洗局部。
可将样品直接放入固定液；细胞内抗原测定需：
冻融法：固定后冻融使细胞膜破裂，标记抗体能进入细胞内。
冰冻切片法：固定后速冻，切成10-15um薄片，融化的切片直接 浸泡于铁蛋白标记的抗体液中。
戊二醛固定后，浸入洋地黄皂甙液中1-2min，增强细胞膜穿透性， 使标记抗体进入细胞内
冰冻超薄切片铁蛋白标记抗体免疫电镜图
特点：
是能在低温下保持低粘度； 具有在光照射下聚合的能力，光聚合作用与温度无关。
K4M和K11M具有亲水性，能较好地保持组织结构和抗原性，减少背景染色； HM20和HM23具疏水性，能产生高反差图像，适用于扫描、透射电镜和暗视 野观察切片的制作。 K4M应用较多
K4M 的应用
1）包埋剂的配制： 由三个部分组成：单体，交联剂和引发剂。 调整单体、交联剂比例，增加交联剂，可增加组织块的硬度。 中等硬度的组织块，其配制比例如下： K4M：单 体 17.30g 交联剂 2.70g 引发剂 0.10g
可用微量注射器加针头抽取后，注入棕色玻璃容器避光，用 玻棒轻搅3—5 min或用一小管通入液氮气泡搅拌。勿过分搅拌， 以防氧的气泡进入包埋剂中。
2) 生物样品处理程序
① 取材，以多聚甲醛一赖氨酸—过碘酸钠固定；
② 含7％蔗糖PBS，冲洗过夜； ③ 0.1 mol／LPBS， pH 7.2冲洗； ④ 系列脱水； ⑤ 包埋：
去除四氧化锇：
免疫染色前，将载网超薄切片以H202液蚀刻数分钟，以去锇和 增强树脂的穿透性。
3 超薄冰冻切片
将组织臵于蔗糖保护液中，以液氮速冻； 在冰冻超薄切片机上切片； 免疫染色。
不需经固定、脱水、包埋等步骤，所以抗原性保存 较好，兼有包埋前和包埋后染色的优点。但技术条 件要求较高、难度较大。
（一）组织固定与取材
原则： 固定： 固定剂的要求： ①不损害细胞内抗原的活性； ②固定速度快、效果好；
既要保存良好的细胞超微结构，又要注意保持组织的抗原性。
③分子量小，易于渗透；
④固定后,不引起交联，造成空间的阻碍，影响标记抗体进入 抗原位。
影响固定的因素有：
① 固定剂的种类；
② 固定剂的浓度，浓度过大，对抗原的活性有影响，浓度 过小，固定效果差；
取材：免疫电镜技术较光镜免疫化学技术要求更迅速、精细。
（二）免疫染色
包埋前染色 包埋后染色 超薄切片免疫染色
1 包埋前染色
即先行免疫染色，在解剖显微镜下将免疫反应阳性部位取 出，修块；常规电镜方法处理，经锇酸固定、脱水、树脂包
埋。
特异性免疫反应的范围太小，可作二次包埋：
即第一次包埋时将组织臵于两层塑料片之间，中夹环氧树 脂如夹心面包式，进行高温聚合，然后在解剖显微镜下取出
物，影响特异性反应产物的显示和观察。
二、几种常用的透射电镜方法要点
（一）铁蛋白标记免疫电镜技术
（二）过氧化物酶标记免疫电镜技术
（三）胶体金标记免疫电镜技术 （四）凝集素标记免疫电镜技术
（一）铁蛋白标记免疫电镜技术
1 原理
铁蛋白：是一种含铁约占23％的蛋白质，铁蛋白含有致密的铁离子核
心，含2000～3000个铁原子，分布于四个区域，形成四个圆形致密 区，具有很高的电子密度，便于电镜观察。 抗体与铁蛋白通过双功能试剂结合为一种双分子复合物。 此复合物保留了抗体的免疫活性，通过电镜可定位抗原。适于细胞表面 抗原的定位
优点：
超微结构保存较好，方法简便，阳性结果有高度的可重复性， 还能在同一超薄切片上进行多重免疫染色。
缺点：
抗原活性在样品处理过程中可能减弱甚至丧失； 环氧树脂中可与组织成份发生反应而改变抗原性质； 包埋在环氧树脂中的组织不易进行免疫反应等。
解决对策： 去除包埋剂：
饱和苯溶液，无水酒精中NaOH饱和溶液或乙氧化钠溶液等。
GMA包埋剂的配制、生物样品处理和电镜水平的免 疫细胞化学染色方法：
1) 过滤: GMA单体溶液在出厂时都加有氢醌类稳定剂，用前须 以每25ml单体溶液加一匙活性碳，在振荡器上振荡5 min，过 滤以除去氢酯，以免影响聚合。 2) 包埋剂的配制： a. 100％GMA N-甲基丙烯酸丁酯 66.5ml 5％乙烯二甲丙烯酸酯 28.5ml 1.5％过氧化苯甲酰 1.0g 1.0％PEG 400 1.0ml
（三）包埋
树脂包埋、低温包埋
1 树脂包埋 环氧树脂包埋法 直接脱水后包埋 原位包埋：将小片组织或半薄切片贴在载片上， 将充满环氧树脂的明胶囊倒臵
于切片上聚合、硬化，进行包埋。
2 低温包埋
低温包埋剂：
（1Leabharlann BaiduLowicryls：
是丙烯酸盐和甲基丙烯酸盐化学物质，包括K4M、HM20、K1lM、KM23等系列 产品。
选用固定剂不宜过强。常采用灌注固定法。 多聚甲醛—戊二醛混合液 过碘酸—赖氨酸一多聚甲醛液(PLP液)： 对含糖类丰富的组织固定效果特佳。 （使用前必须用已知效价的抗原做一系列预实验。如固定剂的 种类浓度、温度、pH及固定时间等。然后做出预处理的效价， 作为失活参考以再选择最适条件。）
灌流后需续固定：四氧化锇
（二）过氧化物酶标记免疫电镜技术
1 原理：利用酶作为抗原抗体复合物的标记物，再经酶对底物作用生成
需要部位作第二次包埋。
包埋前染色的组织，以中层较为理想。
半薄切片可在相差显微镜下不染色观察（PAP），免疫反应部位呈黑点状； HE或甲苯胺蓝染色的半薄切片上，免疫反应部位呈棕黄色。
表层因受机械修整，结构保存不好，深层因抗体不能透入，免疫反应弱或无。
取相连续的超薄切片
为避免电镜铅、铀染色反应与免疫反应之间的混淆，分别以两个铜网捞取， 其中之一进行染色观察，另一以铀单染色或不染色进行对照观察。
第七章
免疫电镜
一 电镜免疫组织化学技术概述
二 几种常用的透射电镜方法要点
一 电镜免疫组织化学技术概述
特异性抗体用电子致密物质，如铁蛋白、胶体金等标记后， 使之与组织超薄切片中的抗原结合，在电镜下观察到标记物所
在位臵，即为抗原抗体反应的部位。
（一）组织固定与取材 （二）免疫染色 （三）包埋 （四）对照试验