临床免疫学PPT：免疫诊断技术

直接标记 直接 打孔 打孔或直接 ANYWAY
流式细胞仪对目标细胞的识别需要借助对MARKER进行
标记的荧光素
用荧光标记抗体
抗体特异性地结合细 胞上对应的抗原
表达该抗原的细胞被 标记上荧光； 抗原表达多的细胞荧 光强度强
阳性细胞百分 比或浓度
靶蛋白浓度
1、流式细胞仪工作原理
标本的准备
2、操作流程 免疫荧光染色
间 接 免 疫 荧 光 法 示 意 图
3、补体结合免疫荧光法：
此法是在间接法的第一步抗原—抗 体反应时加入补体，使之与抗原— 抗体复合物结合；再用荧光素标记 的抗C3抗体进行示踪。
三、免疫印迹技术 (Immunoblotting)
是将凝胶电泳与固相免疫测定结合，先把电泳 分区的蛋白质转移到固相载体，再用酶免疫、 放射免疫等技术测定。该法能分离分子大小不 同的蛋白质并确定其分子量。 常用于检测多种病毒如HIV的抗体或抗原。
PBS洗涤2次 尼龙网过滤
各种组织：包括新鲜实体组织样本、组织活检或 内镜取材标本
酶消化法 机械法 化学处理法
尼龙网过滤
PBS洗涤2次
2）免疫荧光染色
免疫荧光染色的类型（直接、间接） 荧光染色的方法（单色、双色、多色） 荧光染料的种类 荧光染色对照的设置
直接免疫荧光染色
荧光素标记的单抗直接染色 操作简便 背景染色低
荧光染料的种类及荧光光谱
FITC（异硫氰酸荧光素）：绿色，530nm PE（藻红蛋白）：橙黄色，575nm PerCP(多甲藻黄素叶绿素蛋白）：深红色，675nm PI(碘化丙啶）：橙红色，620nm APC(别藻兰蛋白）：红色，660nm
荧光染色对照的设置
CK抗体包被的反应板 加入酶标的CK抗体
加入底物
检测抗原特异性B细胞
二、免疫荧光显微技术 (Immunofluorescence Technique)
是用荧光素（常用的有异硫氰酸荧光素，FITC) 与抗体连接成荧光抗体，再与待测标本的抗原反应， 置荧光显微镜下观察，抗原抗体复合物散发 出荧光，借此对标本中的抗原作鉴定和定位。
一、酶免疫测定技术
(Enzyme Immunoassay, EIA)
是用酶（常用的有辣根过氧化物酶-HRP和碱性磷酸 酶-AP) 标记的抗体进行的抗原抗体反应。EIA将抗原 抗体反应的特异性与酶催化作用的高效性相结合，通 过酶作用于底物后显色来判定结果。
常用的方法有酶联免疫吸附试验和酶免疫组Leabharlann Baidu法，前 者测定可溶性抗原或抗体，后者测定组织中或细胞表 面的抗原。
血液或骨髓、培养细胞样品 体液和各种灌洗液 各种组织
血液或骨髓：EDTA-K2（1.5～2 mg/ml ）抗凝
培养细胞样品：
胰蛋白酶消化 PBS吹打悬浮 低速离心5min PBS洗涤2次 PBS悬浮沉淀细胞
体液和各种灌洗液：包括脱落细胞、胸腹水细胞、 尿液、内镜刷检细胞等
离心取沉淀细胞 PBS悬浮
ELISA（双抗体夹心法）检测抗原
2、酶联免疫斑点法
（Enzyme-Linked Immunospot assay, ELISAPOT)
是在ELISA的基础上建立的检测抗体生成 细胞及细胞因子产生细胞的方法。
加入淋巴细胞
抗原包被的反应板 加入酶标记二抗
加入底物
T细胞产生CK的检测
加入淋巴细胞
CK
1、酶联免疫吸附试验
(Enzyme Linked Immunosorbent Assay, ELISA)
是将已知的抗原或抗体吸附在固相载体（聚苯乙 烯微量反应板）表面，使抗原抗体反应在固相表 面进行。用洗涤法将液相中游离成分洗除。 主要有双抗体夹心法、间接法BAS-ELISA等。
ELISA检测抗体
数据的获取
结果的分析
操作流程图
EDTA抗凝血 100μl
加入荧光标记 的抗体各10μl
溶解红细胞、 洗涤、固定
15 min避光
FCM分析
样本制备非常重要
单细胞悬液 大多数仪器是在50-300 µm大小的孔径中,将细胞悬液
注射进入鞘液中 这一过程,成为流体动力学聚焦
1）常见临床检测标本的准备
免 疫 印 迹 法 示 意 图
四、流式细胞技术
（Flow Cytometry, FCM)
FCM是将免疫荧光技术应用于流式细胞仪，对 单个细胞的表面标志（抗原或受体）进行快速、 精确的分析和自动检测，并将不同类型的细胞分 选收集。
FCM还可对同一细胞的多种参数（如DNA、 RNA、蛋白质和细胞体积等）进行多信息分析， 为当代生命科学研究领域中广泛使用的一项新技 术。
流式细胞仪
BD-Calibur
BD FACSVantage
EPICS XL-ADC
CYTOMICS FC500
EPICS ALTRA
如何让流式细胞仪认识目标细胞？
细 胞
抗体
荧光 MARKER特异性结合物
MARKER
细 胞
细 胞
对细胞进行定量的MARKER可以在细胞的任何部位
细胞膜 细胞器 细胞浆 细胞核 代谢
临床免疫技术
摘要
利用免疫学原理建立的免疫学检测技术应用于：
多种免疫性疾病（感染性疾病、免疫缺陷病、超敏反应、 自身免疫病、免疫增殖病、移植排斥反应和肿瘤等）的 诊断、疗效评估、发病机制探讨、以及对抗原性物质或 免疫细胞的定性、定量，对细胞因子、粘附分子及细胞 受体的检测等。
常用免疫学检测技术：
酶免疫技术 免疫荧光显微技术 免疫印迹技术 流式细胞技术
包括直接荧光法、间接荧光法和补体法。
1、直接荧光法：
将荧光素直接标记抗体作标本染色。该法的优点 是特异性强，但其缺点是每检测一种抗原必须制 备相应的荧光抗体。
2、间接荧光法：
用一抗与标本中的抗原结合，再用荧光素标记的 二抗染色。该法的优点是敏感性比直接法高，制 备一种荧光素标记的二抗可用于多种抗原的检测， 但非特异性荧光亦会增加。
间接免疫荧光染色
未标记的第一抗体 灵敏度高 操作复杂 背景染色增加
荧光素标记的第二抗体
单色免疫荧光染色
number of cells
100
101
102
103
104 100
101
102
103
104 100
101
102
103
104
CD3
CD4
CD8
双色免疫荧光染色
染色方法
第一，表面染色 第二，胞内染色 第三，胞内和表面标记同时检测