软骨细胞培养及其调控

关键词：软骨细胞自从1965年chestman和Smith首先开始软骨细胞体外培养用于软骨缺损修复的研究以来［1］，人们开始对关节软骨损伤不能通过自身的软骨增殖修复的概念有了新的认识。实验证明不仅年幼且年老的关节软骨标本仍可在体外培养出新生透明软骨［2］。虽然软骨细胞增殖能力有限，其质与量直接影响体外培养扩增效果，软骨细胞生长环境不同所表现出的生物学特性也有差别。软骨细胞在悬浮培养或半固体琼脂培养基中生长良好并保持表型稳定，在培养瓶底水凝胶覆盖的四维培养环境中长期培养时软骨细胞可形成结节结构其细胞形态胞外基质分泌和软骨特异性基因表达皆与关节软骨相似。软骨细胞的生长密度对其生长也至关重要。在同样的条件下体外单层培养时，由于细胞密度不同，软骨细胞的生长分裂经过和形态功能完全不同。组织学检查表明，细胞形态不同，其碱性磷酸酶活性、细胞分泌特异性基质的功能及对细胞作用因子的反应也不同，进一步研究表明，软骨细胞靠自分泌或旁分泌信号的方式而存活。1 细胞因子对体外培养软骨细胞的影响软骨细胞的有限增殖性及存活密度的要求是限制软骨细胞单层培养修复关节软骨缺损及体外大量扩增的因素之一，随着细胞生物学的发展，软骨细胞体外培养特异基因表达的研究日益深入，细胞因子参与调节软骨细胞的增殖、分化过程渐被人们所揭示，这对软骨细胞体外培养研究又提出了一个新方向。近年来，关于细胞因子等多肽蛋白质对软骨细胞体外增殖分化等的影响研究也较多。也有些学者发现软骨细胞内含许多细胞因子及其受体，且表明许多细胞因子通过自分泌或旁分泌两种基本方式来调节软骨细胞。目前认为促进软骨细胞增殖和基质合成代谢的细胞因子有：IGFs.TGF-βs.PDGF,FGF.EGF，对软骨细胞有抑制作用的有IL- 1、IL-2、IL-7、TNF-α、IFN-γ等，现就对软骨细胞有显著调节的细胞因子分述如下：1.1 转化生长因子beta(TGF-β) TGF-β最初是由Robert等学者在1978年作为一种可诱导大鼠成纤维细胞增殖因子而描述。T GF-β可以诱导间充质细胞转化为软骨细胞。现已实验证明TGF-βs具有促进软骨细胞增殖、调节其分化和胞外基质合成的能力［3］。F.Redni等实验证明培养兔关节软骨细胞表达了不同的TGFβ受体且与软骨细胞生长周期功能有关，软骨细胞在S期表现了低亲和力受体表型(kd=appiox 1100pm)然而GO/G期的软骨细胞表现了高亲和力受体。因此， TGF-β对软骨细胞的作用有多种受体参与。同时也有实验证明TGF-β更多的结合在GO/G1 期比S期的同步化软骨细胞，从而说明TGF-βs对软骨细胞的作用是通过不同的途径［ 4］。也有学者证明TGF-βs在不同的条件下对成软骨细胞有促进分化或降低分化的双重作用，1-10ng/ml浓度的TGF-β可诱导大鼠胚胎肌细胞分化成软骨细胞，合成特异性的Ⅱ型胶原和蛋白多糖，而在0.4mol/L浓度下，TGF-β可诱导大鼠颅骨成骨细胞的碱性磷酸酶活性，减少软骨细胞Ⅱ型胶原、蛋白多糖的合成［5］。同时也有实验证明TGF-β可抑制培养兔关节软骨细胞的终末分化及钙化。TGF-β可能与多种因素如胞外基质和其它分化调控生? ?］。TGF-β在细胞对其它各种分化信号的应答过程中同样也有调节作用。Wen-Ning Qi等实验证明Ⅱ型胶原能特异的调节TGF- β刺激软骨细胞合成Ⅱ型前胶原DNA和蛋白多糖，同时说明Ⅱ型胶原在TGF-β存在的条件下调节软骨细胞特异性基因表达具有剂量依赖性(量效关系)。因此Ⅱ型胶原基因表达的变化在 TGF存在条件下受Ⅱ型胶原的调控［7，8］。[!--empirenews.page--] 体外实验证明，许多细胞因子对软骨细胞有协同或拮抗作用如TGF-βs、IGFs、FGF、BMP、 IL-1等，兔关节软骨细胞体外培养时，TGF-β对IGF的分泌作用有三种，(1)减少41KD的IG FBP；(2)增加IGF受体的结合位点；

(3)下调了诱导型IGF-1受体的自身磷酸化［9］，从而促进软骨细胞的增殖和特异性基质的合成。也有学者认为TGF-β和IGF可以使反分化的软骨细胞再分化诱导和持久表达Ⅱ型胶原和蛋白多糖［10］。软骨细胞在传代培养中表型的变化可能与软骨细胞自分泌IL-1有关，而TGFβ可作为一种IL-1的拮抗剂，减少了IL-1对胞外基质的分解代谢同时也下调了IL-1受体及其金属蛋白酶的表达［1 1］。TGFβ可能通过以下两种途径拮抗IL-1的作用，(1)刺激成软骨细胞中蛋白糖抑制剂的产生。(2)抑制软骨细胞蛋白酶的产生，因而对细胞外基质的

合成有促进作用［1 2］。1.2 骨形态发生蛋白(BMP) BMP是TGFβ的超家族成员之一，BMP-7(OP-1)是BMP家族中的一员，其对无血清培养的高密度单层细胞和悬浮在琼脂糖中的细胞有促进生长和成熟作用，可增加其碱性磷酸酶活性和提高mRNA和Ⅱ型胶原的合成能力。实验rhBMP(OP-1)能有效促进胚胎和成人关节软骨细胞合成蛋白多糖和Ⅱ型胶原而Ⅰ、Ⅲ型胶原没有增加。也有实验证明OP-1对人软骨细胞特异性胶原、蛋白多糖的促合成作用比IGF-Ⅰ、TGF-β和激活素更显著［13］。在培养软骨细胞生长周期的不同时期，BMP的作用也不同，rhBMP调节软骨细胞增殖、分化作用依赖于细胞的成熟状态，且静止区软骨细胞更敏感，同时对软骨细胞的自分泌也有作用［14 ］。关节软骨细胞原代培养时表达了BMP-4功能性受体。1998年Rach1,venena等实验证明BMP2和维生素C共同作用下培养的软骨细胞没有诱导其肥大，同时BMP-2独自干预下细胞凋亡明显少于维生素C的干预，从而说明软骨细胞向肥大软骨细胞的过度与细胞增殖数量减少而相对高的凋亡水平有关。软骨细胞体外传代培养渐反分化为成纤维样细胞或过度为肥大软骨细胞与细胞生存的微环境有关［15］。1.3 胰岛素样生长因子(IGFs) IGF于1953年由salmon和Danghaday研究表明，IGFs家族由两种相关多肽组成即IGF-Ⅰ和IGF -Ⅱ。在软骨细胞表面有IGF的受体且软骨细胞能合成和分泌这种多肽。IGF-Ⅰ能与软骨细胞膜上的受体结合也以旁分泌和自分泌的方式起作用。IGF-Ⅰ能强烈刺激软骨细胞合成Ⅱ型胶原和蛋白多糖，IGF-Ⅰ还能刺激软骨细胞集落形成和细胞增殖，体内IGF-Ⅰ能促进骨骺软骨生长。而IGF-Ⅱ能刺激软骨细胞DNA和RNA的合成且比IGF-Ⅰ更有效的刺激胚胎细胞的生长。但IGF-Ⅰ对成年软骨细胞的作用强于IGF-Ⅱ，也能促进蛋白多糖的合成。软骨细胞表面的IGF-Ⅱ的受体与IGF-Ⅰ相比，两者的结构与体外活性相似，但体内生物效应不同。而IGF结合蛋白(IGF1BPs)它通过特异性结合IGFs而起作用，尽管目前对IGFBPs的生理功能还不十分清楚，但它们对IGFs的调节作用是肯定的，它们通过结合IGFs减少了IGFs与其受体的相互作用，从而降低了IGFs的活性。onley等人实验表明细胞因子可以调节IGFBPs的产生，IGFBPs反过来调节IGF的作用，同时表明IL-1α、TNF-α降低细胞对IGF-Ⅰ的反应性可能是通过增加IGFBPs而起作用。[!--empirenews.page--]1.4 成纤维细胞生长因子(FGFs) FGFs最初是从牛脑垂体分离出来的一种蛋白质，后来发现它在人体组织包括骨、软骨基质中广泛存在，且对胚胎发育及软骨修复起重要作用。体外实验发现它能促进软骨细胞的增殖、成熟和胞外基质的合成，而bFGF是一种强大的软骨细胞有丝分裂原，它能刺激生长板中软骨细胞蛋白多糖的合成。在成人关节软骨中它与IGF有协同作用，两者协同刺激软骨细胞有丝分裂和蛋白多糖的合成，抑制软骨细胞分化为肥大表型。1.5 白介素和肿瘤坏死因子(IL、TNF) 近来报道IL-1对关节软骨细胞代谢的干预作用主要表现为抑制透明软骨特征性Ⅱ、Ⅳ型胶原的合成，而促进Ⅰ、Ⅲ型胶原的合成使软骨细胞变性，抑制软骨细胞增殖和蛋白多糖的合成同时IL-1对关节软骨的降解作用主要表现在促进软骨细胞合成和分泌金属蛋白酶，并提高软骨基质中溶解蛋白分子酶类的活性。TNF是通过IL-1而抑制Ⅱ型胶原和蛋白多糖的合成，但其作用远弱于IL-1。2 力学刺激对培养软骨细胞的影响关节软骨主要由软骨细胞和胞外基质组成，而胞外基质主要包括胶原和蛋白多糖，其中Ⅱ型胶原占胶原的95%，聚合素是蛋白多糖的主要成分，关节运动时软骨经历循环应力载荷而发生周期性变形和恢复，循环载荷是软骨细胞执行正常功能和维持胞外基质正常表型的基本因素。而体外培养软骨细胞其随传代次数增加而发生代谢、表型的变化伴有Ⅱ、Ⅳ型胶原合成减少，Ⅰ、Ⅲ型胶原合成增加和蛋白多糖分子量的改变，为维持体外培养软骨细胞的正常形态和功能则许多学者进行了软骨细胞培养的力学刺激实验研究。这种压力可分为两种：一种是持续静压力，一种是循环动压力，力学刺激对调控软骨代谢和维持其胞外基质正常表型起重要作用，其中静压力刺激减少了Ⅱ胶原和蛋白多糖的合成，而正常动压力刺激则促进Ⅱ型胶原和蛋白多糖的合成［16，17］，K.Koarninnta［18］实验表明持续高流体静压力抑制蛋白多糖的合成和分泌，减少了聚合素