Westernblot、蛋白质双向电泳的原理、方法及在医学中的应用最终版

等电聚焦
• 通过10000V高压使得蛋白质按照其等电点特性进行聚 焦
• 步骤：胶条水化、低压除盐、高压聚焦、低压维持 • 聚焦时间：聚焦时间太短，会导致水平和垂直条纹，
过长会造成蛋白图谱变性，在胶条碱性端产生水平条 纹以及蛋白丢失。最佳时间的确定需要根据蛋白样品 类型、蛋白载样量、PH范围和胶条长度来确定。
凋亡相关蛋白的表达 Western Blot 检测发现
Bandleader 软件分析凋亡相关蛋白的相对表达 率
Western Blot 检测 SZL 作用 48 h 后凋亡 相关蛋白表达的变化
Western Blot 检测结果的密度分析扫描直方 图 (凋亡相关蛋 白相对表达率 = 条带灰度值
/actin 灰度值)
异性抗体结
2.PVDF膜
灵敏度、分辨 率和蛋白亲和 力比常规的膜 要高，对蛋白 的吸附能力要 远远大于NC膜
3.尼龙膜
对核酸和蛋白 质具有很强的 结合能力，能 代替NC膜用于 分子印迹和杂
交实验。
Baidu Nhomakorabea择膜的标准
选择标准
1.膜与目的蛋白分子的结合能力（也就是单位面积的膜能结合 蛋白的载量），以及膜的孔径（也就是拦截蛋白的大小）
双向电泳（2DE）示意图
等电聚焦，实现蛋白质按等电点 进行分离
大 分子量
SDS-PAGE分离 ，使得蛋白质按 分子量大小排序
小
通过双向电泳使得不同等 电点和分子量的蛋白质根 据其自身特性分布到凝胶 的不同位置从而实现蛋白
质的双向分离
2DE图谱
硝酸银染色图谱
考马斯亮蓝染色图谱
双向电泳（DIGE）示意图
Western Blot的三大医学应用
Western blot法诊断囊虫病
应用荧光定量PCR 和 Western- blot 检测 RNA干扰肺腺癌A549 细 胞STAT3基因表达水平
Western-blot法测定风 疹病毒特异性抗原
1、Western blot法诊断囊虫病
囊虫病是由猪带绦虫幼虫即囊尾蚴寄生于人体引起的人 兽共患寄生虫病。
• 做免疫印迹时选择抗体主要应考虑两个问题，一是所选抗体是否能识别 凝胶电泳后转印至膜上的变性蛋白，另一个是所选抗体是否会引起交叉 反应条带。
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化学显色法
方便、便宜、灵敏 度较低、费抗体、 反应慢、线性窄、 不易保存、不能重 新剥离检测
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31
技术流程
提出 生物学问题
实验组和对照组样品制备
双向电泳(2DE/DIGE)
凝胶图像分析
差异蛋白点选取 蛋白酶解及质谱分析 差异蛋白点的成功鉴定
生物学问题的解释
32
双向电泳(2DE/DIGE)
• 目前进行蛋白质组学分析的最常规实验技术 • 能实现多达10000种不同蛋白质进行分离分析
5
为什么要作蛋白质印迹实验 ？
1
研究一些体外的 蛋白质分子，寻 找目的蛋白是否 存在样品当中
2
不同的样品中检 查蛋白质的表达 情况，上调或下 调表达，如疾病 和正常的样品之 间的表达差异性
6
Western Blot的基本原理
在电场的作用下将电泳分离的多肽从凝胶转移至一 种固相支持体，然后用这种多肽的特异抗体来检测。
• 考马斯亮兰染色： 优点：重复性好，质谱兼容性高 缺点：灵敏度低
• 荧光染色： 优点：重复性好，质谱兼容性高、灵敏度高 缺点：价格贵
• 其它染色方法： 胺基黑染色、印度墨水染色、金属盐负染等
图像分析
• 常用软件： Image-Master (GE Healthcare) PDquest (Bio-Rad)
• 预染分子量标准
单色预染 多色预染
• 修饰分子量标准
糖基化 磷酸化 荧光标记
预混分子量标准
• 高分子量标准 • 低分子量标准 • 宽分子量标准
预染分子量标准
• 单色预染 • 多色预染
修饰分子量标准
• 糖基化 • 磷酸化 • 荧光标记
膜—三种选择
1.硝酸纤维素膜（NC膜）
价格便宜，简单 快速封闭与非特
• 缺点：
• 1. 交叉反应引起的非特异性条带 • 2. 额外的二抗孵育以及条件优化
为什么一般情况下都采用间接法进行检测？
• 直接法与用二抗的间接法相比有诸多不足，标记可用于很多种 不同特异性的一抗，避免了标记很多一抗的需要，同时因为一 抗结合不知一个二抗分子，所以二抗可以增强信号，所以一般 情况下都采用间接法进行检测
2.不影响后续的显色检测（也就是适和用于所选的显色方法， 信噪比好）
3.后继实验有其他要求，比如要做蛋白测序或者质谱分析，还 要根据不同目的来挑选不同的转移膜
膜的特点
抗体的选择
• 作为western来讲，理论上单抗比多抗的特异性要好，但单抗种类较少 一般价格偏高，所以一般来说多抗足够了。用于western的抗体和用于 ELISA的抗体，一般来说用于western的抗体识别的是氨基酸序列特异 性；而可用于ELISA的抗体则要看抗原种类，有些是识别氨基酸序列特 异性，有些是识别构像特异性。所以一般根据抗体说明书来确定。
样品1： Cy3标记
将标记的 样品混合
双向电泳分离
荧光扫描仪扫描
图像重叠分析
DIGE图谱
样品制备
• 双向电泳的最关键步骤之一
• 制备原则：尽可能多地提取出总蛋白质，尽可能简单 的操作步骤，注意防止样品提取过程中的各种化学修 饰，去除样品中核酸、盐离子等干扰物质
增加样品溶解性的手段
变性剂：通过改变溶液中的氢键结构使蛋白质充分伸展，将其疏水 中心完全暴露，降低接近疏水残基的能量域。其典型代表是尿素和 硫尿。
3、Western-blot法测定风疹病毒特异性抗原
• 风疹病毒(ＲＶ) 能够引起先天感染。通过孕妇传播,致使胎儿先天畸形 或导致先天性风疹综合征如先天性心脏病、智力低下等。
• 因此能够早期快速诊断对于优生优育、提高人口素质 、预防后天及再感 染具有重要意义。
• 目前临床上所用的ELISA 检测试剂盒所包被抗原为全细胞粗制抗原 , 特 异度低、灵敏度差,缺乏统一的抗原标准。
• 免疫学试验对本病诊断有重要作用，但目前用各种方法纯化的抗原其 敏感性、特异性均不理想。
• 运用DN A重组技术,构建来源于猪囊尾蚴的cDNA表达文库,以囊虫病患 者血清及病猪血清为抗体,从中筛选出4个特异性抗原（cC1、cC2、cP1 、cH1）,这些抗原克隆经IPTG诱导,形成β-半乳糖苷酶-猪囊尾蚴特异 性抗原的融合蛋白( fusion protein, FP)。
• 现可采用Western-blot的方法,测定风疹病毒的主要抗原性蛋白, 以指导 临床应用 。
04
双向电泳技术的应用
part
研究蛋白质组的三大核心技术:
计算机图像分析与大规模
01
数据处理技术
双向电泳技
03
术(2-DE)
02 质谱技术
作用
双向电泳技术(2-DE)在蛋 白质组学中发挥着重要的 作用,可用于研究样品总蛋 白、不同样品蛋白质表达 差异、蛋白质间相互作用、 蛋白质修饰等。
• 采用简化Western blot法,以等比混和的四种融合蛋白为抗原检测囊 虫病、华支睾吸虫病、包虫病患者血清中的相应抗体
2、应用荧光定量PCR 和Western- blot 检测RNA干 扰肺腺癌A549 细胞STAT3基因表达水平 • Western印迹分析检测STAT3表达 • 荧光定量PCR 检测STAT3mRNA 的表达
Edward M. Southern建立 了将DNA转移到硝酸纤维 素膜 （NC膜）上，并利 用DNA－RNA杂交检测特定 的DNA片段的方法
George Stark对电 泳后的蛋白质分子进 行印迹分析从而发明 western印迹技术
1975 1979 同年 最终
McMaster和Carmichael 对RNA进行印迹分析，发 明 Northern印迹技术
表面活性剂：经过变性剂处理而暴露蛋白质的疏水基团后，还常需 至少一种表面活性剂来溶解疏水基团。常用的表面活性剂有离子去 污剂SDS、非离子去污剂Triton X-100和NP-40、两性离子去污剂 CHAPS、OBG等。其中CHAPS和SB3-10最好。
还原剂：在变性剂和表面活性剂联用条件下，加用还原剂可使已变 性的蛋白质展开更完全，溶解更彻底。常用含自由巯基的DTT或巯基乙醇，以及不带电荷的三丁基膦（TBP）进行还原。
Western Blotting间接法操作流程
Western Blotting 设计标准
分子量 标准
膜的选择
抗体
显色结果
不可小看“蛋白标准”--分子量标准的选择
修饰分子 量标准
预染分子 量标准
分子量标准
预混分子 量标准
15
不可小看“蛋白标准”--分子量标准的选择
• 预混分子量标准
高分子量标准 低分子量标准 宽分子量标准
Western Blotting 操作流程
蛋白样品的制备 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳
转膜 封闭 一抗孵育 二抗孵育 底物显色
Western Blotting 操作流程
第三步
第五步
底物显色
第一步
一抗杂交
转膜
第二步
封闭
第四步
二抗杂交
9
Western Blotting 方法一: 直接法
• 优点：
• 1.快速（一种抗体） • 2.没有二抗交叉反应引起的非特异性条带
蛋白检测
理想显色剂的7S
• 安全（safety） • 灵敏（sensitivity） • 简单（simplicity） • 特异性（specificity） • 快速（speed） • 稳定（stability） • 兼容性（synergy）
蛋白检测
• 硝酸银染色 优点：灵敏度高， 缺点：重复性差，质谱兼容性低
显色的 方法
化学发光法
灵敏、快速、节省抗 体、反应快、线性宽、 无害、特异性高、可 重新剥离检测
同位素法
灵敏度高、不安全 、环境污染、不方 便和半衰期短
荧光底物法
Krypton ™荧光底物
2
蛋白质双向电泳的原理
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25
双向电泳的实验原理
◆第一向：等电聚焦 ◆第二向：SDS—PAGE电泳
Western blot 、蛋白质双向电泳的 原理、方法及在医学中的应用
湘雅医学院精神医学1301班
CONTENTS
1
Western blot 原理及方法
2
蛋白质双向电 泳的原理
4
应用
3
蛋白质 双向电 泳的方
法
2
1
Western blot原理及方法
蛋白质印迹法
3
Western blotting
26
第一向：等电聚焦
第二向：SDS—PAGE电泳
• 聚丙烯酰胺是由单体丙烯酰胺(Arc)和交联剂N,N-甲叉丙烯 酰胺(Bis)在加速剂N,N,N’—四甲基乙二胺（TEMED）和催 化剂硫酸铵（AP）或核黄素的作用下聚合交联成三维网状 的凝胶，以此凝胶为支持物的电泳称为PAGE。
30
3
蛋白质双向电泳的方法
• 分析步骤：胶点检测和定量、凝胶匹配、比较分析
凝胶的图像处理分析和典型流程
• 凝胶图像的扫描： • 图像加工： • 斑点检测和定量： • 凝胶配比： • 数据分析： • 数据呈递和解释： • 2-DE数据库的建立：
4
应用
Western blot及蛋白质双向电泳
47
Western Blot的医学应 用
Western blotting！！
4
什么是蛋白质印迹法 ？
Westernblot法 是凝胶电泳技术、固定化技术及分 子亲和技术三者融为一体的综合性技术，其核心在 于把凝胶已分离的区带并印迹于固化纸上，可分为 电泳、转印、酶免疫测定3个阶段。Westernblot法 结合了电泳的高分辨率和酶免疫测定的高敏感性和 特异性，是一种能用于分析样本组分的免疫学测定 的方法。
• 缺点：
• 1.免疫反应性降低 • 2.无信号二级放大 • 3.抗体标记费时昂贵,使用不方便
Western Blotting 方法二: 间接法
• 优点：
• 1. 免疫特异性不受标记影响 • 2. 信号放大灵敏度高（多个二抗结合位点） • 3. 多种标记的二抗可供选择 • 4. 可选择不同的Marker
起载体作用的两性电解质：即便在变性剂和表面活性剂 存在的情况下，某些蛋白质也需要在盐离子的作用下 才能保持其处于溶解状态，否则这些蛋白质在其处于PI 点时会发生沉淀。
Carrier ampholytes的作用在于捕获样品中的少量盐分， 从而保证蛋白质的溶解性。应用时，两性电解质的浓 度应小于0.2％（w/v)。浓度过高会使IEF的速度降低。 另外，为了保证实验的精确性，在选择不同pH范围的 IPG胶条时，也应使两性电解质的pH值与之相符合。