DNA指纹技术及其应用

DNA指纹技术及其应用

周珊珊（浙大环科所，杭州310029）

摘要综合比较、分析了目前常DNA指纹技术，如RFLP、VNRT、RARP、AFLP、STS(SSR、CAPS、SCAR)、RFLP、SSCP、SNP等的原理、特点和适用范围，简要介绍了DNA指纹技术的研究发现状以及发展前景。

关键词DNA指纹技术；分子杂交；PCR技术；DNA芯片技术

前言

DNA指纹图谱是一种在单一实验中可检测出大量DNA位点差异性的分子生物学技术。1985年，Jeffreys及其合作者[1]分析了人的肌红蛋白基因，从中获得了多位点的小卫星探针。它可同时与众多的DNA限制性酶切电泳图谱杂交，可得到具多条带的复杂图谱。这种表现出高度的种属及个体特异性的杂交图谱即称为DNA指纹图谱(DNA fingerprint)。随着各种高水平探针如报卫星探针、寡聚核苷酸探针的相继问世，成为当今最先进的分子水平上的遗传标记系统。指纹图谱具有高度的变异性及多位点性，充分体现了物种的遗传多态性，使其在动植物科学研究、遗传疾病的诊断、基因图谱的绘制，遗传标记及法医学等方面得到广泛应用。本文将对几类主要的DNA指纹技术原理及特点做简要叙述，并进一步阐述其发展前景。

1．DNA指纹技术原理及特点

2.1 基于分子杂交技术的DNA指纹技术

2.1.1 限制性片断长度多态性（Restriction Fragment Length Polymorphism, RFLP）

某些DNA序列的差异可通过限制性酶切片段长度的改变反映出来，此即限制性片段长度多态性(RFLP)。1980年Botstein等[2]首先提出利用RFLP作为标记构建遗传图图谱。其主要原因是由于DNA序列个别碱基的突变而引起某个限制性内切酶识别位点的获得或丢失，表现为不同长度的酶切片段。

RFLP的等位基因具有共显性特点。RFLP标记位点数量不受限制，通常可检测的基因座位数为1～4个[3]。RFLP结合基因探针分析的最大优点是产生的带型清楚明确。这是因为相当大量的DNA被切割，电泳和染色后的DNA片段易于显示出来。相反，PCR产生的指纹(如AP－PCR或ERIC－PCR产生的指纹)很难以再现并可能“模糊的”或“假的”带，使其难以解释。RFLP技术也存在一些缺陷，主要是

克隆可表现基因组DNA多态性的探针较为困难；另外，实验操作较繁琐，检测周期长，成本费用也很高[4]。

2.1.2 数目变串联重复多态性（Variable Number of Tandem Repeats, VNRT） VNTR首先由Wyman和White[5]在筛选人DNA基因文库时得到，当时他们称之为：高变重复区。VNTR是继RFLP之后的一类具有高度多态性的遗传标记，这类基因顺序多位于基因非编码区，以及染色体的近端粒区[6,7]，目前对其确切功能不明。按非编码的重复序列在DNA分子上分布的方式，可分为散布重复序列和串联重复序列，而串联重复序列又根据重复单位大小不同可分为：（1）小卫星序列，重复单元核心序列含有6～70bp，中间无间隔，总长度一般小于1kbp；（2）微卫星序列，或简称重复序列（Simple Sepuence Repeats,SSR）重复单元含有1～6bp[8]。

每个特定位点的VNTR由两部分组成：中间的核心区和外围的侧翼区[6]，核心区含有至少一个以上称为“重复”的短序列，一般假设该重复单位的碱基对数目几乎不变，而串联在一起的重复单位数日是随机改变的。如果用一种不切重复单位的限制酶把DNA分子切割成限制性片段，该限制性片段中位于核心区外围的即是侧翼区。我们可根据重复单位或侧翼区大小、序列的不同及拷贝数的不同来进行基因组多态性的分析。

许多酶都能在其侧翼区找到切点，并且等位基因多，杂合子比例较高，加上VNTR位点等位基因呈孟德尔经典遗传，放作为良好的遗传标记系统，它比RFLP 更具有应用价值。

2.2 基于PCR技术的DNA指纹图谱技术

2.2.1 随机扩增多态性DNA（Random Amplified Polymorphism DNA RAPD）

随机扩增多态性DNA（RAPD）是1990年首次由William等[9]提出的用于监测DNA多态性的新型的PCR技术。它是利用单个的、任意序列的寡聚核苷酸（一般选用9～10个[13]）作引物，随机地与靶序列完全或部分配对，以扩增出特异的DAN产物。由于引物的设计不需要特异的核苷酸序列信息，避免了PCR特异性引物设计上的困难。另外，多个引物对同一标本DNA的全方位扫描可使检测区域扩展以至整个基因组，从而得到更广泛的DNA多态信息，甚至能监测出单个碱基的变化[10]。

RAPD分析因其引物序列的任意性及其低退火温度决定了其反应的非严格性，它比一般PCR更易受到很多因素的影响，如DNA的制备，引物、模板浓度的比率，离子浓度，DNA聚合酶，PCR循环多数，变性、复性温度及时间，温度变换速率，PCR仪等等。这些因素改变，扩增出的图谱便不同。这些影响因素不具有遗传性，而是由人为因素造成的，它将影响对基因组多态性的正确评价，影响实验的重复性。目前优化RAPD反应的条件，将真实的反应产物与这些人为因素的影响区别开来，仍RAPD分析的研究重点[11，12]。

2.2.2 序列标志位点（STS）

特定序列位点(sequence-tagged site)是对由其特定引物序列所界定的一类标记的统称。利用特异PCR技术的最大优点是它产生的信息非常可靠，而不像RAPD、AFLP和利用随机探针产生的RFLP存在某种模糊性(如难以鉴别片段的来源)。这类分子标记主要包括以下几种分子标记。

2.2.2.1简单重复序列（SSR）

SSR(simple sequuence repeats)由l～6个碱基组成的基本序列串联重复短片段，如(GT)n，(GATA)n等组成。人们可根据其两侧独的序列设计引物，进行PCR扩增，再用琼脂糖凝胶或变性聚丙稀酰胺凝胶电泳分离产物，检测多态性SSR 作为分子标记的优点是技术简便、快速，稳定性高，检测获得的多态性位点多，遗传变异信息量大。Genbank、EMBL、DDBJ等DNA序列数据库的建立使SSR技术的应用更为方便。

针对高度密集CA微卫星简单重复序列设计中由于重复CA引物对高度重复靶位点易形成扩增条带涂布现象，Zietkiewicz等[13]提出了锚定SSR(ASSR,或ISSR)的新策略。即在SSR的3'端或5'端锚定1～4个简并碱基，避免了SSR在基因组上的滑动，大大提高了聚合酶链式反应扩增的专一性。在所在两端的引物中，可以一个为锚定引物，另一个为随机引物[8]。

2.2.2.2 酶切扩增多态性序列（Cleaved Amplified Polymorphism Sequences，CAPS）

CAPS技术又称为PCR-RFLP，它实质上是PCR技术与RFLP技术结合的一种方法。其基本步骤是：根据已有的DNA数据资源设计出一套特异引物，然后进行PCR扩增，接着用一种专一性的限制性内切酶切割所得的扩增产物，凝胶电泳分