生物制药 抗体药物

• 单克隆抗体还可作为载体制备导向药物。但是要 解决以下两个问题：（1）鼠源性单克隆抗体的免 疫原性；（2）完整的抗体分子分子量过大（10万 以上），难以穿透实体肿瘤组织，达不到有效的 治疗浓度。
• 解决办法： (1) 降低单克隆抗体的免疫原性； (2) 降低单克隆抗体的相对分子质量。
第二节 单克隆抗体及其制备
• 现代免疫学时期：在这一时期，确认了淋巴细胞 系在免疫反应中的地位，阐明了免疫球蛋白的分 子结构与功能。
免疫球蛋白
相关概念
• 抗体是指能与相应抗原特异性结合具有免疫功能 的球蛋白。
• 抗体的产生：机体免疫系统受抗原刺激后，B淋巴 细胞被活化增殖和分化为浆细胞，由浆细胞合成 和分泌的球蛋白。
• 经典免疫学时期：18世纪至20世纪中叶为经典免 疫学时期。这一时期，人们对免疫功能的认识由 人体现象的观察进入了科学实验时期。在此期间 取得的重要成果包括：
• （1）牛痘苗的发明：患过牛痘的挤奶工不再患病
• （2）减毒活疫苗的发明：19世纪末，法国免疫学 家巴斯德（Pasteur）和德国细菌学家柯赫（Koch） 在创立了细菌分离培养技术的基础上，通过系统 地科学研究，利用物理、化学，以及生物学方法 获得了减毒菌苗，并用于疾病的预防和治疗。 Pasteur以高温培养法制备了炭疽疫苗，用狂犬病 毒在兔体内经连续传代制备了狂犬病疫苗。这些 减毒疫苗的发明不但为实验免疫学打下了基础， 也为疫苗的发展开辟了新局面。
• （3）诱导剂PEG的影响：分子量及浓度越大，促融率 越高，但其粘度和对细胞的毒性也随之增大。目前常 用的PEG的浓度为40%-50%，相对分子质量以4000为佳。
为了提高融合率，在PEG溶液中加入二甲基亚砜 （DMSO）。但必须严格限制它们和细胞的接触时间， 可通过低速离心5min使细胞接触更为紧密，然后用新 配制的培养液来稀释药物并洗涤细胞。
• 20世纪60年代初期：抗原决定簇，精制单价血清。 • 1975年：Köhler和Milstein等，单克隆抗体，其
具有高度特异性、均一性，以及来源稳定可大量 生产等特点。 • 1984年：人-鼠嵌合抗体（30:70) • 1984年至今：单克隆抗体的鼠源性及分子过大的 问题得以解决，可仅作为与抗原特异性结合试剂。
T淋巴细胞
B淋巴细胞
2、抗体药物的发展
• 1890年：Behring和北里柴三郎等发现了白喉抗毒 素，并建立了血清疗法，开抗体制药之先河。
白喉杆菌
• 1937年：Tiselius等人用电泳法将血清蛋 白分为白蛋白、甲种（）球蛋白、乙种 （ ）球蛋白和丙种（ ）球蛋白，并 证明抗体活性主要存在于丙种球蛋白组分。
• 在制备恶性肿瘤细胞表面抗原的单克隆抗体时， 情况较复杂，需用整个肿瘤细胞做为免疫原，经 过筛选、克隆化，制备出仅存在于肿瘤细胞而不 存在于正常细胞上的表面标志分子上的单克隆抗 体。
• （2）稳定的杂交瘤的获得 因免疫动物品系和骨髓瘤细胞在种系发生上距离越 远，产生的杂交瘤越不稳定，故一般采用与骨髓瘤 供体同一品系的动物进行免疫。目前常用的骨髓瘤 细胞系多来自BALB/c小鼠和Lou大鼠，因此免疫动物 也多采用相应的品系，最常用的也是BALB/c小鼠。
• 体外免疫法：所需要的抗原量少，一般只需几个g， 免疫期短，仅4-5天，干扰因素少，已成功制备出 针对多种抗原的单克隆抗体，但融合后产生的杂交 瘤细胞株不够稳定。其基本方法是用4-8周龄 BALB/c小鼠的脾脏制成单个细胞悬液，再加入适 当抗原使其浓度达0.5-5 g/mL，在5%CO2、37℃下 培养4-5天，再分离脾脏细胞，进行细胞融合。
BALB/c小鼠：1923年美国培育，1985年引进我国。 Lou大鼠：1972年美国培育，1985年引进我国。
• （3）免疫方法：体内免疫法和体外免疫法
体内免疫法：适用于免疫原性强、抗原量较多时应 用，一般用8-12周龄的雌性鼠。颗粒性抗原（如细 菌、细胞抗原）的免疫原性强，可不加佐剂，直接 注入腹腔107个细胞进行初次免疫，间隔1-3周，再 追加免疫1-2次，可溶性抗原则按每只小鼠10-100g 抗原与福氏完全佐剂等量混合后注入腹腔内，进行 初次免疫，间隔2-4周，再用不加佐剂的原抗原追加 免疫1-2次。
六、单克隆抗体的纯化
• 1、澄清和沉淀处理 小鼠腹水中含有红细胞、细胞碎块、纤维蛋白凝
块及脂质等，应首先用离心力1000g离心5min，去 除残留的小颗粒物质；再用0.2m的微孔滤膜过滤， 除掉污染的细菌、支原体和脂质；用饱和硫酸铵沉 淀抗体，50%饱和硫酸铵能回收90%以上的单克隆抗 体。
• 2、分离
洗涤 2、加杂交瘤培养上清液（ ）
（4℃，1h）
洗涤 3、加辣根过氧化物酶标记的羊 抗鼠抗体（ ） （4℃，1h）
洗涤 4、加酶作用底物，呈色孔为阳 性克隆孔
• （2）克隆化——有限稀释法和软琼脂法 筛选出来的阳性克隆中，可能含有不分泌抗体
的细胞或有多株分泌抗体的细胞，而且刚刚融合 获得的杂交瘤细胞不稳定，染色体容易丢失，因 此应尽早克隆化。
• 细胞融合后可产生多种融合，脾—脾、脾—瘤、 瘤—瘤融合细胞，以及未融合的细胞。
• （4）培养基的正确选择：常用的选择培养基为HAT 培养基，它是次黄嘌呤（H）、氨基喋呤（A）和胸 腺嘧啶（T）配制的。
• （5）选择性培养方法：
细胞悬浮
96孔板
换液（HAT培养
液）
改用HT培养液
普通的
RPMI1640完全培养液。从融合后8-9天就可对
一般认为免疫学的发展经历了四个时期即经验 免疫学时期、经典免疫学时期、近代免疫学时期 和现代免疫学时期。
• 经验免疫学时期：早在公元 11 世纪，我国医学家 在实践中创造性地发明了人痘苗，即用人工轻度 感染的方法预防天花。在明代隆庆年间（朱载垕， 1567～1572），人痘苗已在我国广泛应用。
• 至17世纪，人痘苗接种预防天花的方法引起邻国 的注意，先后传入俄国、朝鲜、日本、土耳其、 英国等地，进而使人痘苗预防天花的方法得以推 广和验证。此即经验免疫学时期。它是人类认识 机体免疫性的开端，为以后英国医生Jenner（琴纳） 发明牛痘苗奠定了基础。该时期发现了免疫现象， 对医学实为一项伟大贡献。
第四章 抗体制药
张忠山
• 第一节 概述 • 第二节 单克隆抗体及制备 • 第三节 基因工程抗体及制备 • 第四节 多功能抗体及制备 • 第五节 抗体工程 • 第六节 抗体诊断试剂 • 第七节 抗体治疗药物
第一节 概述
• 1、免疫学发展经历 免疫学是一门既古老而又新兴的科学。免疫学
的发展是人们在实践中不断探索、不断总结和不 断创新的结果。
• 后来，人们相继发现了凝集素、沉淀素等能与细 菌或细胞特异性反应的物质，统称为抗体；而将 能引起抗体产生的物质称为抗原，从而确立了抗 原和抗体的概念。
• 免疫抗原；反应抗原
• 近代免疫学时期：生物体的免疫反应性有了比较 全面的认识，出现了全新的免疫学理论。包括迟 发性超敏反应、免疫耐受的发现、细胞系选择学 说的提出、免疫学技术的发展。
（2）抗体性状的鉴定
• 可用羊或兔抗Ig不同类和亚类的抗体，进行免疫扩 散或ELISA法来鉴定。在单克隆抗体鉴定中还必须 进行亲和力测定，它可为正确选择不同用途的单克 隆抗体提供依据。另外根据需要不同，还应对单克 隆抗体的特异性、纯度和识别抗原的相对分子量等 进行测定。
五、单克隆抗体的大量制备
（1）体外培养法可获得10g/ml的抗体。 （2）动物体内诱生法，可获得5-20mg/ml的抗体。
目前多采用后者生产制备单克隆抗体。因为杂 交瘤细胞的两种亲本细胞均来自BALB/c小鼠，所 以应选用BALB/c小鼠来制备单克隆抗体。
• 动物体内诱生法操作简便，也比较经济，所得单 克隆抗体量较多且效价亦高，还可有效地保存杂 交瘤细胞株和分离已污染杂菌的杂交瘤细胞株， 缺点是小鼠腹水中混有来自小鼠的多种杂蛋白， 给纯化带来难度。
• 软琼脂法是在培养液中加入0.5%左右的琼脂糖凝 胶，细胞分裂后形成小球样团块，由于培养基是 半固体状态，可用毛细吸管将小球吸出，团块打 碎后，移入96孔板中继续培养。用这种方法可以 吸出大量克隆细胞进行培养，因初代细胞很不易 增殖，所以用软琼脂法进行克隆化容易成功。
四、杂交瘤细胞与抗体性状的鉴定
3、筛选阳性克隆与克隆化
• （1）筛选阳性克隆： 因为产生特定抗原的抗体产生细胞只占所有脾
细胞的5%左右，所以要进行每孔培养上清的抗体 活性的筛选工作，以选择出阳性克隆，然后进行 克隆化培养。
常用的检测方法有免疫酶技术、免疫荧光技术 和放射免疫技术等。
ELISA用于破伤风抗体的筛选
1、精制破伤风毒素抗原（ ）吸附 （约10g/ml，4℃，3h）
• 一般融合后获得的 杂交瘤细胞要经过大约3次的 克隆化，才能达到100%孔内均为抗体阳性细胞克 隆。常用的克隆化方法有有限稀释法和软琼脂法。
• 有限稀释法是把杂交瘤细胞悬液稀释后，加入到 96孔细胞培养板中，使每个孔中在理论上只含有 一个细胞。第一次克隆化时也要应用HT培养液， 以后的克隆化可用不含HT的RPMI1640培养液。由 于单个细胞难以存活，克隆化时也需加入饲养细 胞辅助其生长。
（1）杂交瘤细胞的鉴定 • 正常鼠的脾细胞染色体数为40，全部是端着丝粒染
色体。杂交瘤细胞的染色体在数目上接近两种亲本 细胞染色体数目的总和，在结构上除多数为端着丝 粒染色体外，还应出现少数标志染色体。 • 染色体数目较多又比较集中的杂交瘤细胞能稳定分 泌高效价的抗体，而染色体数目少且比较分散的杂 交瘤细胞分泌抗体的能力较低。
根据用途可选用不同）凝胶过滤 用于IgG和IgM类单克隆抗体的分 离纯化。常用Sephadex G200作分离介质，可收集 到三个峰，最高峰为IgM，另两个峰为IgG，抗体 回收率达50%-80%，能去除污染的微量杂蛋白， 抗体纯度可达95%以上。
• （3）抗体的发现：1890年德国学者Behring（贝 苓）和日本学者北里用白喉外毒素免疫动物时发 现，在被免疫的动物血清中有一种能中和外毒素 的物质，称为抗毒素。将此免疫血清被动转移给 正常动物，使后者获得了中和外毒素的能力。同 年Behring又与北里将白喉抗毒素正式用于白喉的 治疗，开创了人工被动免疫疗法之先河。为此， Behring于1901年获得诺贝尔医学和生理学奖。
• 1、抗原与动物免疫 • 2、细胞融合与杂交瘤细胞的选择性培养 • 3、筛选阳性克隆与克隆化 • 4、杂交瘤细胞与抗体性状的鉴定 • 5、单克隆抗体的大量制备 • 6、单克隆抗体的纯化
1、抗原与动物免疫
• （1）制备用于动物免疫的适当抗原。 a、 化学合成抗原，如精制的地高辛。 b、 多数情况下抗原物质只能得到部分纯化，甚 至是极不纯的混合物，如部分纯化的干扰素。 c、通过克隆化选出最适当的单克隆抗体。
2、细胞融合与杂交瘤细胞的 选择性培养
• （1）细胞融合基本方法：取适量脾细胞（1×108） 与骨髓瘤细胞（2×107 -3×107）进行混合，在聚乙 二醇（PEG）作用下诱导它们融合，时间控制在2min 以内，然后用培养液将PEG融合液缓慢稀释。
• （2）用于融合的骨髓瘤细胞应具备条件：融合率 高，自身不分泌抗体，所产生的杂交瘤细胞分泌 抗体的能力强且长期稳定等特点。
抗原决定簇
特殊化学基团
喉类毒素：8个， 流感病毒：40多个
抗原 脾 B淋巴细胞
淋巴细胞
骨髓瘤细胞
单克隆抗体
和多克隆抗
融合 融合
体的制备
克隆1 克隆2 克隆3 克隆4
3、单克隆抗体的应用
• 用于疾病的诊断和治疗：如利用单克隆抗体检测与 某些疾病相关的抗原，辅助临床诊断，或用放射性 核素标记单克隆抗体进行肿瘤显像，进行免疫鉴定。 用于临床治疗，如针对T淋巴细胞共有的分化抗原 CD3的单克隆抗体，用作免疫抑制剂。
所有克隆生长孔的培养上清进行抗体检测，筛
选出产生抗体的阳性克隆。
• （6）饲养细胞：
由于在最适的条件下大约有105个脾细胞才能形 成一个杂交瘤细胞，大量瘤细胞在HAT培养液中相 继死亡，单个或少数的杂交瘤细胞多半不能存活， 所以通常要加入饲养细胞才能使其繁殖。
常用的饲养细胞有小鼠腹腔巨噬细胞、脾细胞 和胸腺细胞等。