农杆菌介导转化法的概述

学年第学期

2014 级硕士生生物化学期末论文

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2015 年 6 月 20 日

农杆菌介导转化法的概述

摘要：自从1983年转基因植物诞生以来，植物基因工程成为发展最快、应用潜力最大的生物技术领域之一。植物转基因技术是指把从动物、植物或微生物中分离到的目的基因，通过各种方法转移到植物的基因组中，使之稳定遗传并赋予植物新的农艺性状，如抗虫、抗病、抗逆、高产、优质等。［1］

目前，应用于植物转基因较多的方法有基因枪轰击法和农杆菌介导法。由于基因枪轰击的随机性，容易出现突变、丢失和引起基因沉默等不利于外源基因在宿主植物的稳定表达的缺点，而农杆菌介导法是一种天然的植物遗传转化系统, 外源基因在转基因植物中的拷贝数低、遗传稳定，是最常用的转基因技术［2］。农杆菌介导法起初只被用于双子叶植物中，近年来，农杆菌介导转化法在一些单子叶植物（尤其是水稻）中也得到了广泛应用。本文对农杆菌介导转化法进行综述。关键词：农杆菌转化方法转化效率

1关于农杆菌

农杆菌［3-5］是普遍存在于土壤中的一种革兰氏阴性细菌，它能在自然条件下趋化性的感染大多数双子叶植物的受伤部位，并诱导产生冠瘿瘤或发状根。与植物基因转化有关的有根瘤农杆菌和发根农杆菌这两种类型。

1.1根癌农杆菌

依据Ti质粒诱导的植物细胞产生的冠瘿碱的种类不同，根癌农杆菌可分为4 种类型：章鱼碱型（Octopine）、胭脂碱型（Nopaline）、农杆碱型（Agropine）和琥珀碱型（Succinamopine）。

原始的Ti质粒根据其功能的不同可分为4个区： 1.1.1T-DNA区（Transfer—DNA region）：不同来源的菌株，T-DNA的长度在12~24 kb，它是在农杆菌侵染细胞时，从Ti质粒上切割下来转移到植物基因组中的一段DNA，其携带的基因与肿瘤的形成有关，但与T-DNA本身的转移与整合无关．T-DNA上最重要的是T-DNA区两端的边界各为25 bp的重复序列．其中14 bp是完全保守的，分10 bp（CAGGAATATAT）和4 bp（GTAA）不连续的2组．左右2 个边界（LB 和RB）是T —DNA 转移所必需的，只要其存在，T-DNA 可以将携带的任何基因转移并整合到植物基因组中，转移的方向是从右向左，T-DNA 的右边界在T-DNA 的整合中对于靶DNA位点的识别具有重要作用，因此，尤以右边界更为重要。

1.1.2 毒性区（vir 区）：位于T-DNA 以外的1 个30-40kb 的区域内，该区段编码的基因虽然并不整合进植物基因组中，但对T-DNA的转移和整合非常重要。这些基因也称为Ti质粒编码毒性基因（vir）。目前，对章鱼碱型农杆菌Ti质粒pTi15955 和胭脂碱型农杆菌Ti质粒pTiC58的vir区进行了全序列分析，在章鱼

碱型Ti质粒的vir 区发现了8 个操纵子，分别为virA-vjrH，共包括23 个基因（virA，virB1-virB11，virC1，virC2，virD1-virD4，virE1，virE2，virF，virG，virH）．而胭脂碱型Ti质粒的vir 区不含vjrF和virH操纵子，它含有另一个基因tzs ，也有学者认为有大约35个vir 基因成簇排布于vir区。

1.1.3 接合转移区（Con 区）：该区段存在有与细菌间接合转移有关的基因（tra），调控Ti 质粒在农杆菌间转移。

1.1.4 复制起始区（ori 区）：该区段调控Ti 质粒的自我复制。在遗传转化过程中除了Ti质粒上的基因参与外，还有农杆菌染色体基因．染色体基因包chvA、chvB、att、pscA、chvD 以及chvB．它们大多编码一些膜相关蛋白，负责细菌向植物受伤细胞趋化移动和帮助细菌附着于植物受伤细胞上。

1.2发根农杆菌

发根农杆菌（Agrobacterium rhizogenes）含有Ri 质粒，能够诱导被侵染的植物细胞产生毛发状根。其侵染植物是将其Ri质粒上的T-DNA插入到宿主植物基因组中，这一点与Ti质粒相类似。转移机制也类似，所不同的是vir区和T-DNA 区所含基因及其同源性不同。发根农杆菌由于宿主植物损伤部位产生的酚类化合物而附着在植物的细胞壁上，virA的产物是一种跨膜蛋白，进一步激活virG的产物。T-DNA区的TL区具有较高的稳定性，TR区具有与生长素合成有关的基因tmsl 和tms2 及农杆碱或甘露碱合成基因。TR 区可进行改造，这样Ri 通过农杆菌细胞膜特定“孔道”进入宿主植物细胞核，进而使T-DNA 整合到植物基因组中。

2转化过程

农杆菌介导的T-DNA的转移和整合是细菌和植物细胞相互作用发生生物学效应的过程，兼具原核生物中的细菌结合转移及真核细胞加工修饰的特点。其转化过程［6-8］如下：

2.1细菌在植物伤口处附着，使受伤的植物组织产生酚类化合物，诱导Ti 质粒内vir 基因的表达．

在植物受到创伤后，创伤组织的细胞释放出酚类化合物信号，如乙酰丁香

酮（As）。当农杆菌接受到此类信号时，其vir 区基因可被诱导转录。另一类诱

导化合物是组成植物细胞壁的一些特异单糖，As和单糖可协同诱导Ti质粒上vir 区基因的表达。Vir 区基因的活化首先是从virA 基因开始的。VirA 蛋白是一种结合在膜上的化学受体蛋白，可直接对植物产生的酚类化合物感应，其感应部位可能位于胞质区域。VirA 蛋白的胞质区域有自激酶的功能，自身被磷酸化激活后，使VirG 蛋白活化。VirG 蛋白是DNA 结合活化蛋白，可以以二体或多体形式结合到vir 启动子的特定区域，从而成为其它vir 基因转录的激活因子，打开VirB、virC、virD、virE、virH 等几个基因。virC、virD、virE 参与T-DNA 复合体的形成和转移．ChvE 可结合一些单糖，也可直接与VirA 周质区相互作用，以加强As 对Vir 基因的诱导。

2.2vir基因表达的产物作用于T-DNA 产生T-DNA 链，进而转化形成T-DNA 复合体，随后在植物及细菌蛋白的共同作用下被摄入细胞核内。

VirD基因编码的两个产物VirD1和VirD2 直接参与加工过程．VirD1 蛋白是一种拓扑异构酶，可将超螺旋型DNA变成松弛型DNA．VirD2蛋白具有特异剪切单链DNA 的内切酶活性，它可以识别T-DNA底链边界重复序列上的特定位点，并在底链24 bp重复序列和第四个碱基之间切割，将T-DNA从Ti质粒上剪切下来，称T-链。切开T-DNA 后，VirD2 蛋白与T 一链的5'端共价结合，避免核酸外切酶降解T 一链．新的T-DNA底链以此链为模板，从右端产生的DNA 缺口处以5'-3'方向进行合成。被取代的旧链游离出来，与许多VirE2 蛋白分子结合组成T-DNA复合体。此外，VirD2作为一个导向蛋白，可以指导整个T-DNA 复合体从农杆菌进入到植物细胞核。

2.3T-DNA 整合进入植物基因组并表达产生生物学效应．

T-DNA整合进宿主细胞基因组，是转化过程中最重要也最关键的步骤。

T-DNA在寄主细胞染色体上的整合是随机的，但对转录活化区域有所偏好。T-DNA通过与事先断裂的寄主DNA双链(DSB)发生重组来完成整合，进而进行表达。

3转化方法

目前农杆菌介导转化单子叶植物最常用的方法是共培养法。利用农杆菌与植