科学仪器学 基因测序仪

荧光标记终止底物法使标记和终止过程合二为一，两者在同一时 间完成
在具体操作中，前者要求A、C、G、T四个反应分别进行，而后 者的四种反应可以在同一管中完成

（二）新生链的荧光标记原理
单色荧光标记法

也包括荧光标记引物法和荧光标记终止底物法 与多色荧光标记法不同的是单色荧光标记引物法和荧 光标记终止底物法均需将A、C、G、T四个反应分别 在不同扩增管中进行，电泳时各管产物也分别在不同 泳道中电泳
（一）双脱氧链末端终止法测序原理
据此原理分别设计四个反应体系，每一反应体系中存在相同 的DNA模板、引物、四种dNTP和一种ddNTP(如ddATP)，则新合成的
DNA链在可能掺入正常dNTP的位置都有可能掺入ddNTP而导致新合 成链在不同的位置终止。由于存在ddNTP与dNTP的竞争，生成的反 应产物是一系列长度不同的多核苷酸片段。

早期采用同位素法标记新生链，因其具有放射性危害、背景高等 缺点而很快被荧光染料标记法所取代

荧光染料的荧光和散射背景较弱，提高了信噪比；它们的激发光
谱较接近而发射光谱均位于可见光范围，且不同染料的发射光谱
相互分开，易于监测，故在DNA自动测序中得到广泛应用
（二）新生链的荧光标记原理

荧光染料 标记法
（一）双脱氧链末端终止法测序原理
Template
dNTPs
Polymerase
Primer
Terminator
A
G
C
T
双脱氧链末端终止法测序反应原理（1）
（一）双脱氧链末端终止法测序原理
AC T G G C C T AAT C G A G T C A G T
T TGAC C G GA T
G
C T C C A A C A

（三）荧光标记DNA的检测原理
多色荧光标记技术检测优点：

一个样本的四个测序反应产物可以同时在一个泳道内电泳，避免 单一标记时四个泳道测序因泳道间迁移率不同对精确度的影响， 提高了测序精度

一个样品所有反应产物只需进样一次，所以一次实验便可以处理 较之手工方法更多的样品。在相同样品数的情况下，加样的工作 量也大大减少
（二）仪器各组成部分的功能
(2)凝胶块区功能

①注射器驱动杆：给注射器提供正压力，将注射器内 的凝胶注入毛细管中。在分析每一个样品前，泵自动 冲掉上一次分析用过的胶，灌入新胶； ②样品盘按钮：控制自动进样器进出； ③注射器固定平台：起固定注射器的作用； ④电极：为电泳的正性电极，始终浸泡在正极缓冲液 中；
（二）仪器各组成部分的功能

②加热板：电泳过程中起加热毛细管的作用，一 般维持在50℃； ③毛细管：为填充有凝胶高分子聚合物的玻璃管， 直径为50m，电泳时样品在毛细管内从负极向正 极泳动； ④热敏胶带：将毛细管固定在加热板上。


（二）仪器各组成部分的功能
2. 微型计算机功能

控制主机的运行，并对来自主机的数据进行收集和分 析。设置测序条件（样品的进样量、电泳的温度、时 间、电压等），同步监测电泳情况并进行数据分析
T G C
T T G
T G
A
G G
C
A
T
双脱氧链末端终止法测序反应原理（2）
（一）双脱氧链末端终止法测序原理
T
双脱氧链末端终止法测序反应原理（3）
（一）双脱氧链末端终止法测序原理
A
C
G
双脱氧链末端终止法测序反应原理（4）
（一）双脱氧链末端终止法测序原理
双脱氧链末端终止法测序反应原理（5）
（二）新生链的荧光标记原理

利用DNA的体外合成过程－－聚合酶链反应（polymerase
chain reaction, PCR）


DNA聚合酶的催化 以目的DNA为模板 按照碱基互补配对原则 在引物的引导下
单核苷酸聚合形成新DNA链
（一）双脱氧链末端终止法测序原理

普通的PCR反应体系中，加入的核 苷酸单体为 4种2’-脱氧核苷三磷酸 （dATP，dCTP，dGTP，dTTP）

都是根据在某一固定的点开始核苷酸链的延伸，随机在某一个特 定的碱基处终止，产生A、T、C、G四组不同长度的一系列核苷 酸链，在变性聚丙烯酰胺凝胶上电泳进行片段的分离和检测，从 而获得DNA序列

双脱氧链末端终止法更简便和更适合于光学自动探测，故在全自 动DNA测序仪中应用广泛
（一）双脱氧链末端终止法测序原理

（二）新生链的荧光标记原理

荧光标记引物法
Primer
Primer
Primer
Primer
A
G
C
T
荧光标记引物法原理
（二）新生链的荧光标记原理
多色荧光标记法 -- 荧光标记终止底物法

定义：将荧光染料标记在作为终止底物的双脱氧单核苷酸上 反应中将4种ddNTP分别用4种不同的荧光染料标记，带有荧光 基团的ddNTP在掺入DNA片段导致链延伸终止的同时，也使该 片段端标上了一种特定的荧光染料 经电泳后将各个荧光谱带分开，根据荧光颜色的不同来判断所 代表的不同碱基信息
（二）仪器各组成部分的功能

②电极为电泳的负性电极，测序过程中，正、负极之 间的电势差可达15000伏，如此高的电势差可促进 DNA分子在毛细管中很快泳动，达到快速分离不同长 度DNA片段的目的； ③样品盘有48孔和96孔两种，可一次性连续测试48 或96个样本；


④电极固定螺母起固定电极及毛细管的作用。
dNTP结构示意图
（一）双脱氧链末端终止法测序原理

测序反应体系中，加入的核苷酸单体
为 2’,3’-双脱氧核苷三磷酸
（ddNTP）
ddNTP结构示意图
（一）双脱氧链末端终止法测序原理
与dNTP相比，ddNTP在脱氧核糖的位置上缺少一个羟基，
反应过程中虽然可以在DNA聚合酶作用下，通过其磷酸基团与 正在延伸的DNA链的末端脱氧核糖-OH发生反应，形成磷酸二酯 键而掺入到DNA链中，但它们本身没有-OH，不能同后续的dNTP 形成磷酸二酯键，从而使正在延伸的DNA链在此终止。
测序仪
DNA测序

核苷酸序列
早期：小片段重叠法 通过测定RNA序列来推测DNA序列 缺点：既费时又不准确 20世纪80年代以后 ：DNA自动测序仪 Sanger双脱氧链末端终止法 Maxam-Gilber化学降解法 优点：操作简单、安全、快速、准确

一、全自动DNA测序仪工作原理
Sanger双脱氧链末端终止法 Maxam-Gilber化学降解法
（二）新生链的荧光标记原理
单色荧光标记法与多色荧光标记法的异同点：


均可分为荧光标记引物法和荧光标记终止底物法 单色荧光标记法需将A、C、G、T四个反应分别在不同扩增管中 进行，电泳时各管产物也分别在不同泳道中电泳
多色荧光标记引物法需将A、C、G、T四个反应分别在不同扩增 管中进行，电泳时可合并在同一泳道中电泳 多色荧光标记终止底物法可将A、C、G、T四个反应在同一扩增 管中进行，电泳时在同一泳道中电泳
内容提要
一、工作原理 （一）双脱氧链末端终止法测序原理 （二）新生链的荧光标记原理 （三）荧光标记DNA的检测原理 二、全自动DNA测序仪的结构与功能 （一）仪器的组成 （二）仪器各组成部分的功能 三、全自动DNA测序仪的常见故障及维护 （一）毛细管电泳型DNA测序仪的常见故障及维护 （二）平板电泳型DNA测序仪的常见故障及维护 四、全自动DNA测序仪的进展 五、全自动DNA测序仪的主要应用 小结
影响实验结果的因素



模板的影响：模板DNA不纯；定量不准；难测 模板 循环测序反应条件：引物的影响；富含GC的 模板 电泳的影响
二、全自动DNA测序仪的结构与功能
平板型电泳 毛细管电泳
全自动DNA测序仪

平板型电泳的凝胶灌制在两块玻璃板中间，聚合后厚度一般小 于0.4mm或更少，因此又称为超薄片层凝胶电泳 毛细管电泳技术将凝胶高分子聚合物灌制于毛细管中（内径 50m～100m），在高压及较低浓度胶的条件下实现DNA片 段的快速分离

（一）仪器的组成

主机： 主要包括电泳系统、激光器和荧光检测系 统 ；大致可分为自动进样器区 、凝胶块区 和 检测区等结构功能区

微型计算机 各种应用软件

（一）仪器的组成 -- PE310 基因分
析仪
PE310 基因分析仪的结构
（一）仪器的组成 -- PE310 基因分析仪
检测区
凝胶块区
自动进样器区

（三）荧光标记DNA的检测原理

DNA片段上的荧光发色基团吸收了激光束提供的能量而发射出特 征波长的荧光
代表不同碱基信息的不同颜色荧光经过光栅分光后再投射到CCD 摄像机上同步成像。收集的荧光信号再传输给计算机加以处理


整个电泳过程结束时在检测区某一点上采集的所有荧光信号就转 化为一个以时间为横轴坐标，荧光波长种类和强度为纵轴的信号 数据的集合 经测序分析软件对这些原始数据进行分析，最后的测序结果以一 种清晰直观的图形显示出来
PE310 基因分析仪的主机分区
注射器驱动杆
热板
毛细管
雷射检测器
注射器
毛细管和电极
自动进样器
泵块
正极缓冲液 负极缓冲液
PE310 基因分析仪的基本结构
（二）仪器各组成部分的功能
1. 主机功能
具有自动灌胶、进样、电泳、荧光检测等功能
(1)自动进样器区功能

①自动进样器受程序控制进行三维移动，因负极电极 和毛细管均固定不动，故许多操作如毛细管进入样品 盘标本孔中进样、电极和毛细管在电极缓冲液瓶、洗 涤液和废液管中移动等均依靠自动进样器的移动完成；

（二）仪器各组成部分的功能



⑤正极缓冲液阀：当注射器驱动杆下移，将注射器内 的凝胶压入毛细管时，缓冲液阀关闭，以防止胶进入 缓冲液；电泳时此阀打开，提供电流通道； ⑥玻璃注射器：储存凝胶高分子聚合物以及在填充毛 细管时提供必要的压力； ⑦毛细管固定螺母：固定毛细管； ⑧废液阀：在清洗泵块时控制废液流。

（二）新生链的荧光标记原理
A G C T
模板：T C C A T G A T 产物：A G AG G AGG T AGGT A AGGTA C AGGTAC T AGGTACT
新生链的荧光标记原理
A
（二）新生链的荧光标记原理
荧光标记引物法和荧光标记终止底物法的异同点：

都确定了4种荧光染料与4种ddNTP所终止的DNA片段之间的专一 对应关系 荧光标记引物法使荧光有色基团标记在长短不同的DNA片段的端， 可理解为荧光染料标记过程和延伸反应终止分别发生在同一DNA 片段的两端，且标记发生在引物与模板的退火过程中，而终止是 发生在片段延伸过程中，两者在时间上有一定间隔
3.各类软件功能

承担数据收集、DNA序列分析及DNA片段大小和定 量分析等功能。其结果可由彩色打印机输出
三、全自动DNA测序仪的常见故障及维护
电泳时仪器显示无电流
毛细管电泳型DNA测序仪
电极弯曲
电泳时产生电弧 其它
平板电泳型DNA测序仪
电泳时仪器显示无电流
传热板粘住胶板
其它源自文库
（一）毛细管电泳型DNA测序仪的常见故 障及维护
（二）仪器各组成部分的功能
(3)检测区功能

①激光检测器窗口及窗盖：激光检测器窗口正对毛细 管检测窗口，从仪器内部的氩离子激光器发出的激光 可通过激光检测器窗口照到毛细管检测窗口上。电泳 时，当荧光标记DNA链上的荧光基团通过毛细管窗口 时，受到激光的激发而产生特征性的荧光光谱，荧光 经分光光栅分光后投射到CCD摄像机上同步成像。窗 盖起固定毛细管的作用，同时可防止激光外泄；


（三）荧光标记DNA的检测原理

测序反应一般以单引物进行DNA聚合酶延伸反应，绝大多数产物 均为单链
反应结束后，样品经简单纯化处理就可以放置到自动测序仪中开 始电泳


两极间极高的电势差推动着各个荧光DNA片段在凝胶高分子聚合 物中从负极向正级泳动并达到相互分离，且依次通过检测窗口 由激光器发出的极细光束，通过精密的光学系统被导向检测区， 在这里激光束以与凝胶垂直的角度激发荧光DNA片段
单色荧光标记法
荧光标记引物法 荧光标记终止底物法 荧光标记引物法
荧光标记终止底物法
多色荧光标记法
5
（二）新生链的荧光标记原理
多色荧光标记法 -- 荧光标记引物法

定义：将荧光染料预先标记在测序反应所用引物的5’端 一组（4种）荧光标记引物，其序列相同，但标记的荧光染料颜色 不同
测序反应中，模板、反应底物、DNA聚合酶及标记引物等按A、T、 C、G编号被置于4支微量离心管中，A、T、C、G四个测序反应 分管进行，上样时合并在一个泳道内电泳。特定颜色荧光标记的 引物则与特定的双脱氧核苷酸底物保持对应关系