小鼠肝原代细胞分离

小鼠肝原代细胞分离

(Hong Tang Lab_ZC_20110709) 准备: D-Hanks, Hanks, Percoll, PBS, 1640培养基（10% FBS, 1% P/S）, William E培养基（10% FBS, 1% P/S），胶原酶IV, 麻醉剂, 无菌手术器械，10cm培养板，15mL, 50mL 离心管, 70um滤网，20mL注射器，头皮针，小鼠固定架，移液器，70%酒精

操作流程：

a.37o C预热D-hanks(不含钙镁离子，补加5mM EDTA)及Hanks(含0.025% 胶原

酶IV)溶液；

b.麻醉小鼠，用75%酒精进行体表消毒；

c.将小鼠四肢固定，打开腹腔，从下腔静脉进针，剪开肝门静脉，用预热的

D-Hanks溶液进行灌注；（打开腹腔后，向上翻开肠道及左叶肝脏，即能很清晰暴露肝门静脉和下腔静脉。进针后，先缓推液体，确认液体流入血管，再剪开肝门静脉，低速均匀进行灌注，约20mL/10min, 以灌干净血液为准）d.换20mL含0.025%胶原酶IV的Hanks溶液进行灌注，完成后原位消化3-5min;

（消化好的肝脏表现为按压后，回弹变慢）

e.取下肝脏，放入加入10mL预冷1640培养基的10cm皿中，用镊子或注射器

头敲碎肝组织; （轻柔）

f.滤网过滤，用适量培养基清洗残余组织块，控制总体积约30mL；

g.50g离心3min @ 4o C, 上清为非实质细胞，沉淀主要为实质细胞；

h.（可选）用20mL预冷35% percoll（13mL 1640培养基+6.3mL Percoll+0.7mL 10X

PBS）重悬沉淀，1500rpm离心8min@4 o C。

i.吸去上清，用10mL培养基重悬沉淀，800 rpm离心5min。重复一次；

j.计数，将细胞稀释至2*105/mL铺板。（一般一个小鼠肝脏能分得5-10*107实质细胞）

k.3小时或隔夜后，吸掉培养上清，去除未贴壁细胞，换用William E培养基培养。

试剂信息：