【资料】酶谱法检测血清中基质金属蛋白酶mmp2和mmp9活性汇编
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（2）明胶酶，包括MMP-2和MMP-9,其作用底物主要是Ⅳ型胶原和明胶，还可降解Ⅶ、 Ⅸ、Ⅹ型胶原,但不能降解间质胶原； （3）间充质溶解素，包括MMP-3、MMP-7、MMP-10和MMP-11，其作用底物主要是 基质中的蛋白多糖和糖蛋白，如纤维粘连蛋白(FN)、层粘连蛋白(LN)，间充质溶解素 对胶原的作用不同于间质胶原酶和明胶酶，它们能降解Ⅳ、Ⅴ、Ⅷ、Ⅹ型胶原酶以及 Ⅰ型胶原的氨基端。
催化剂
丙烯酰胺 N,N′-甲叉（亚甲基） 双丙烯酰胺
聚丙烯酰胺
聚丙烯酰胺凝胶有下列特性：
1. 在一定浓度时，凝胶透明，有弹性，机械性能好； 2. 化学性能稳定，与被分离物不起化学反应，在很多溶剂中不溶； 3. 对pH和温度变化较稳定； 4. 几乎无吸附和电渗作用，只要Acr纯度高，操作条件一致，则样品分离重复性好； 5. 样品不易扩散，且用量少，其灵敏度可达10-6g； 6. 凝胶孔径可调节，根据被分离物的分子量选择合适的浓度，通过改变单体及交联剂的浓
➢ 肿瘤细胞对周围组织和血管的侵袭是肿瘤细胞转移的关键步骤。 ➢ 转移的肿瘤细胞在原灶外存活和增殖，这是癌症对人类生命的最大威胁。
细胞间基质结构示意图
➢ 细胞外基质(extracellular matrix，ECM)主要成份由胶原、糖蛋白、蛋白多糖和氨基 葡聚糖组成。
➢ ECM在上皮或内皮细胞的基底部，即以基底膜(basement membranes，BM)的形式存 在，在细胞间结构以间质结缔组织(interstitial connective tissue)形式存在。
度调节凝胶的孔径； 7. 分辨率高，尤其在不连续凝胶电泳中，集浓缩、分子筛和电荷效应为一体。因而较醋酸
纤维薄膜电泳、琼脂糖电泳等有更高的分辨率。
SDS－PAGE的原理
➢ 聚丙烯酰胺凝胶电泳是网状结构，具有分子筛效应，蛋白质在电泳中保持完整的状 态，蛋白在其中依三种因素分开：蛋白大小，形状和电荷。
➢ 而SDS-PAGE仅根据蛋白分子量亚基的不同而分离蛋白。这个技术首先是1967年由 shapiro建立，他们发现在样品介质和丙烯酰胺凝胶中加入离子去污剂和强还原剂后， 蛋白质亚基的电泳迁移率主要取决于亚基分子量的大小，电荷因素可以忽视。
➢ SDS（Sodium Dodecyl Sulfate）是阴离子去污剂，作为变性剂和助溶试剂，它能断 裂分子内和分子间的氢键，使分子去折叠，破坏蛋白分子的二、三级结构。而强还 原剂如巯基乙醇，二硫苏糖醇能使绊胱氨酸残基间的二硫键断裂。在样品和凝胶中 加入还原剂和SDS后，分子被解聚成多肽链，解聚后的氨基酸侧链和SDS结合成蛋白 - SDS胶束，所带的负电荷大大超过了蛋白原有的蛋白量，这样就消除了不同分子间 的电荷差异和结构差异。
➢ 胶原是ECM的主要成分，目前已发现，至少有12种不同胶原类型，其中以I、Ⅱ、Ⅲ 型胶原是间质结缔组织中的主要成分。Ⅳ型胶原则主要存在于基底膜内。
➢ 肿瘤细胞的侵袭是需要与细胞增殖、分化、移动的相关基因及其表达调控模式的改变 和促进细胞移动的外界因素两者的共同作用。
➢ 虽然肿瘤细胞侵袭的分子机制还不是十分清楚，但已发现许多调控细胞侵袭转移的关 键分子及其信号通路。
➢ 中性粒细胞明胶酶相关载脂蛋白（neutrophil gelatinase associated lipocalin， NGAL)是1993年Kjeldsen等人在研究MMP-9在细胞内存在形式时发现的，它能够 与MMP-9聚合形成异源二聚体，保护和调节MMP-9活性，从而促进恶变细胞的浸 润和转移。
➢ 肿瘤细胞通过其表面受体与ECM中的各种成分粘附后激活或分泌蛋白降解酶类来降 解基质，从而形成局部溶解区，构成了肿瘤细胞转移运行通道。一般恶性程度高的肿 瘤细胞具有较强的蛋白水解作用，可侵蚀破坏包膜，促进转移。目前较为关注的酶主 要是丝氨酸蛋白酶类，如纤溶酶原激活物(plasminogen activator, PA)和金属蛋白酶 (metalproteinase, MMP)类，如胶原酶IV、基质降解酶、透明质酸酶。
➢ 因此在电泳时，蛋白质分子的迁移速度则主要取决于蛋白质分子大小。
不同分子量的蛋白质在凝胶中运动示意图
不同聚丙烯酰胺凝胶浓度对不同分子量的 蛋白质混合物分离能力的关系
5％
10％
15％
200
200
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97
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66
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45
45
29 29
45
29
肿瘤细胞的侵袭移动
ห้องสมุดไป่ตู้
A
C
B
D
➢ 肿瘤细胞侵袭是指肿瘤细胞粘附并穿越细胞外基质，包括三个重要的步骤： 粘附于基膜，裂解基膜蛋白形成缺口，细胞经缺口移动。
基质金属蛋白酶蛋白家族
➢ MMPs家族成员根据其在细胞中表达部位的不同，分为胞质型和膜型两大类。前者分 布在胞质中，后者表达在膜上。胞质型MMPs根据其作用底物的特异性、敏感性及氨 基酸序列的同源性分为三大类：
（1）间质胶原酶，包括MMP-1、MMP-5、MMP-8、MMP-13，其作用底物主要为间 质胶原, 即Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅶ、Ⅹ型胶原, 但不能降解明胶和Ⅳ型胶原；
酶谱法检测血清中基质金属蛋白 酶MMP2和MMP9活性
电泳设备
垂直电泳系统
水平电泳系统
聚丙烯酰胺凝胶电泳原理
聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺(acrylamide，简称Acr)和交联剂N,N′-甲叉双丙烯酰胺 (N,N ′ -methylene-bisacylamide,简称Bis)在加速剂 N,N,N,N-四甲基乙二胺(N,N,N,Ntetram-ethyl ethylenedia mine，简称TEMED)和催化剂过硫酸铵(ammonium persulfate (NH4)2S2O3，简称AP) 的作用下聚合交联成三维网状结构的凝胶，以此凝胶为支持物的 电泳称为聚丙烯酰胺凝胶电泳(polyacrylamide gel electrophoresis，简称PAGE)。
➢ 通过影响细胞外基质，基质金属蛋白酶蛋白家族参与胚胎发育、形态发生、组织重塑 等过程，并参与炎症、肿瘤、心血管、神经等许多疾病过程。
➢ MMP-2又叫明胶酶A， 其蛋白主要由纤维结缔组织细胞和肿瘤细胞产生，分子量 为72kDa。
➢ MMP-9又称为明胶酶B，主要由单核细胞、巨噬细胞多形核白细胞和肿瘤细胞产 生。分子量为92kDa，是MMPs中分子量最大的酶。
催化剂
丙烯酰胺 N,N′-甲叉（亚甲基） 双丙烯酰胺
聚丙烯酰胺
聚丙烯酰胺凝胶有下列特性：
1. 在一定浓度时，凝胶透明，有弹性，机械性能好； 2. 化学性能稳定，与被分离物不起化学反应，在很多溶剂中不溶； 3. 对pH和温度变化较稳定； 4. 几乎无吸附和电渗作用，只要Acr纯度高，操作条件一致，则样品分离重复性好； 5. 样品不易扩散，且用量少，其灵敏度可达10-6g； 6. 凝胶孔径可调节，根据被分离物的分子量选择合适的浓度，通过改变单体及交联剂的浓
➢ 肿瘤细胞对周围组织和血管的侵袭是肿瘤细胞转移的关键步骤。 ➢ 转移的肿瘤细胞在原灶外存活和增殖，这是癌症对人类生命的最大威胁。
细胞间基质结构示意图
➢ 细胞外基质(extracellular matrix，ECM)主要成份由胶原、糖蛋白、蛋白多糖和氨基 葡聚糖组成。
➢ ECM在上皮或内皮细胞的基底部，即以基底膜(basement membranes，BM)的形式存 在，在细胞间结构以间质结缔组织(interstitial connective tissue)形式存在。
度调节凝胶的孔径； 7. 分辨率高，尤其在不连续凝胶电泳中，集浓缩、分子筛和电荷效应为一体。因而较醋酸
纤维薄膜电泳、琼脂糖电泳等有更高的分辨率。
SDS－PAGE的原理
➢ 聚丙烯酰胺凝胶电泳是网状结构，具有分子筛效应，蛋白质在电泳中保持完整的状 态，蛋白在其中依三种因素分开：蛋白大小，形状和电荷。
➢ 而SDS-PAGE仅根据蛋白分子量亚基的不同而分离蛋白。这个技术首先是1967年由 shapiro建立，他们发现在样品介质和丙烯酰胺凝胶中加入离子去污剂和强还原剂后， 蛋白质亚基的电泳迁移率主要取决于亚基分子量的大小，电荷因素可以忽视。
➢ SDS（Sodium Dodecyl Sulfate）是阴离子去污剂，作为变性剂和助溶试剂，它能断 裂分子内和分子间的氢键，使分子去折叠，破坏蛋白分子的二、三级结构。而强还 原剂如巯基乙醇，二硫苏糖醇能使绊胱氨酸残基间的二硫键断裂。在样品和凝胶中 加入还原剂和SDS后，分子被解聚成多肽链，解聚后的氨基酸侧链和SDS结合成蛋白 - SDS胶束，所带的负电荷大大超过了蛋白原有的蛋白量，这样就消除了不同分子间 的电荷差异和结构差异。
➢ 胶原是ECM的主要成分，目前已发现，至少有12种不同胶原类型，其中以I、Ⅱ、Ⅲ 型胶原是间质结缔组织中的主要成分。Ⅳ型胶原则主要存在于基底膜内。
➢ 肿瘤细胞的侵袭是需要与细胞增殖、分化、移动的相关基因及其表达调控模式的改变 和促进细胞移动的外界因素两者的共同作用。
➢ 虽然肿瘤细胞侵袭的分子机制还不是十分清楚，但已发现许多调控细胞侵袭转移的关 键分子及其信号通路。
➢ 中性粒细胞明胶酶相关载脂蛋白（neutrophil gelatinase associated lipocalin， NGAL)是1993年Kjeldsen等人在研究MMP-9在细胞内存在形式时发现的，它能够 与MMP-9聚合形成异源二聚体，保护和调节MMP-9活性，从而促进恶变细胞的浸 润和转移。
➢ 肿瘤细胞通过其表面受体与ECM中的各种成分粘附后激活或分泌蛋白降解酶类来降 解基质，从而形成局部溶解区，构成了肿瘤细胞转移运行通道。一般恶性程度高的肿 瘤细胞具有较强的蛋白水解作用，可侵蚀破坏包膜，促进转移。目前较为关注的酶主 要是丝氨酸蛋白酶类，如纤溶酶原激活物(plasminogen activator, PA)和金属蛋白酶 (metalproteinase, MMP)类，如胶原酶IV、基质降解酶、透明质酸酶。
➢ 因此在电泳时，蛋白质分子的迁移速度则主要取决于蛋白质分子大小。
不同分子量的蛋白质在凝胶中运动示意图
不同聚丙烯酰胺凝胶浓度对不同分子量的 蛋白质混合物分离能力的关系
5％
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肿瘤细胞的侵袭移动
ห้องสมุดไป่ตู้
A
C
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D
➢ 肿瘤细胞侵袭是指肿瘤细胞粘附并穿越细胞外基质，包括三个重要的步骤： 粘附于基膜，裂解基膜蛋白形成缺口，细胞经缺口移动。
基质金属蛋白酶蛋白家族
➢ MMPs家族成员根据其在细胞中表达部位的不同，分为胞质型和膜型两大类。前者分 布在胞质中，后者表达在膜上。胞质型MMPs根据其作用底物的特异性、敏感性及氨 基酸序列的同源性分为三大类：
（1）间质胶原酶，包括MMP-1、MMP-5、MMP-8、MMP-13，其作用底物主要为间 质胶原, 即Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅶ、Ⅹ型胶原, 但不能降解明胶和Ⅳ型胶原；
酶谱法检测血清中基质金属蛋白 酶MMP2和MMP9活性
电泳设备
垂直电泳系统
水平电泳系统
聚丙烯酰胺凝胶电泳原理
聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺(acrylamide，简称Acr)和交联剂N,N′-甲叉双丙烯酰胺 (N,N ′ -methylene-bisacylamide,简称Bis)在加速剂 N,N,N,N-四甲基乙二胺(N,N,N,Ntetram-ethyl ethylenedia mine，简称TEMED)和催化剂过硫酸铵(ammonium persulfate (NH4)2S2O3，简称AP) 的作用下聚合交联成三维网状结构的凝胶，以此凝胶为支持物的 电泳称为聚丙烯酰胺凝胶电泳(polyacrylamide gel electrophoresis，简称PAGE)。
➢ 通过影响细胞外基质，基质金属蛋白酶蛋白家族参与胚胎发育、形态发生、组织重塑 等过程，并参与炎症、肿瘤、心血管、神经等许多疾病过程。
➢ MMP-2又叫明胶酶A， 其蛋白主要由纤维结缔组织细胞和肿瘤细胞产生，分子量 为72kDa。
➢ MMP-9又称为明胶酶B，主要由单核细胞、巨噬细胞多形核白细胞和肿瘤细胞产 生。分子量为92kDa，是MMPs中分子量最大的酶。