第九章_细菌感染的分子生物学检验

（2）耐异烟肼分子机制：结核杆菌耐异烟肼与过氧化氢 酶-过氧化物酶编码基因(katG)、烯酰基还原酶编码基因 (inhA)、烷基过氧化氢酶还原酶编码基因(ahpC)、β2S酮 酰基酰基运载蛋白合成酶编码基因(kasA)有关。 主要是katG基因的点突变、缺失、插入，完全缺失占异 烟肼耐药菌株的7%~24%，主要出现于高水平耐异烟肼 分离株中，随机突变占50%~70%，常见的点突变是315 位AGC→ACC和463位CGG→CTG。 inhA基因突变约占异烟肼临床耐药株的10%~35%。耐药 的发生可由于inhA结构基因突变造成异烟肼与DADH的亲 和力下降，或是inhA启动子-15的C→T的点突变可能创造 一个强有力的启动，使inhA蛋白过度表达从而提高对异 烟肼活性形式所需的浓度，引起对异烟肼耐药， inhA基 因的突变常出现低水平异烟肼耐药性。
（5）耐乙胺丁醇分子机制：耐乙胺丁醇主要与操纵子 cmbB基因有关， cmbB突变导致糖基转移酶结构，影响 乙胺丁醇和糖基转移酶的结合而产生耐药，其中第306 位密码子的错义突变最为常见。 （6）耐氟喹诺酮类药物分子机制：氟喹诺酮类药物主 要靶位是结核杆菌的DNA旋转酶，该酶由gyrA和gyrB两 种基因编码的两个A亚单位和两个β亚单位组成。 其中编码的gyrA基因发生突变则导致氟喹诺酮类药物结 合位点构象改变，从而产生耐药性。 突变大多数发生在gyrA基因保守区67~106位密码子区， 常见有94位GAC→GCC或CAC或TAC， 90位GCC→GTG的突变。
第一节 细菌感染的分子生物学检验策略
分子生物学检验是以核酸（DNA或RNA）或蛋 白质分子为检验目标，通过检查人体内源基因 或外源（病原体）基因的存在、缺陷或表达异 常，对人体状态或疾病作出特异性诊断的方法 和过程。
机体感染细菌后，应用分子生物学技术直接测 定这些细菌病原体基因，不仅可以对微生物感 染作出明确诊断，同时也能诊断出带菌者或潜 在性感染，还可以对感染性病原体进行分型和 耐药性监测。
3、PCR-RFLP 通过PCR扩增分枝杆菌染色体上一段 DNA，将扩增产物经限制性内切酶消化（最常用的内切 酶是PvuⅡ)，将消化的样品进行琼脂糖凝胶电泳分析， 不同分枝杆菌酶切片段的数量或大小不同，电泳图谱呈 现多态性。
4、线性探针杂交 其原理是应用生物素标记的特异引 物进行靶核酸的扩增，将产物变性后与固定在尼龙膜上 的特异寡核苷酸探针杂交，通过酶免疫显色法显示结果， 一次杂交可以检测多种靶序列。简便、快速、敏感。
TB是一种革兰氏阳性菌，G+C含量高，其细胞壁 除肽聚糖层外，还含有另外一层由特殊脂质、糖 脂和多糖组成的附加层。TB呈细长略弯曲，常聚 集成团，用抗酸性染色被染成红色。
对养要培求特殊条件，一 般要经4-6周才出现肉眼可 见的菌落。TB通过呼吸道、 消化道和破损的皮肤粘膜 侵入机体，它被吞噬后能 在吞噬细胞内繁殖，导致 巨噬细胞裂解，还可在细 胞外繁殖。
2、结核分枝杆菌耐药性检测的分子生物学技术 （1）DNA测序：该技术是检测基因突变的金标 准，不仅可用于突变的筛选，而且能确定突变碱 基的部位和分布。 （2）PCR-SSCP （3）PCR-RFLP （4）PCR-ROB （5）基因芯片技术
三、分子生物学检验的临床意义 传统的结核病的临床诊断主要是根据病史、细 菌培养、涂片抗酸染色找TB、免疫学方法检测 TB抗原或抗体、胸片等可对大多数患者做出正 确的临床诊断，但对部分病人可造成误诊或漏 诊。分子生物学方法为TB的临床诊断提供了一 种快速、准确的诊断方法，具有以下特点：
（二）结核分枝杆菌的耐药性检测
结核分枝杆菌耐药的分子机制是由于结核杆菌的特定基 因某些碱基出现突变（插入、缺失、替换）而造成。 1、结核分枝杆菌的耐药机制 （1）耐利福平分子机制：是由于其作用靶标—结核杆菌 DNA依赖RNA聚合酶β亚单位的编码基因（rpoB）突变 所致。 当rpoB中507~533位密码子的核心区域—耐利福平决定 区(RRDR)发生突变时，使DNA依赖RNA聚合酶β亚单位 酶结构改变利福平不能与细菌的RNA聚合酶β亚单位结 合而表现为耐药。 其中以编码531位氨基酸的碱基TCG→TTG和编码526位 氨基酸的碱基CAC→TAC的突变最常见。
5、链替代扩增技术 （ SDA） SDA是一种基于酶促反应的新的DNA体外等温扩增技术。 基本原理： 引物与靶DNA序列上对应的DNA单链杂交，在聚合酶作 用下产生带HincⅡ识别位点含5’和3’端的靶DNA序列， 该靶序列进入DSA循环；HincⅡ限制性核酸内切酶切割 识别位点，依赖DNA聚合酶在切割处延伸3’端，并替 代另一条DNA链；该替代链与引物杂交后又依次作为另 一扩增反应的靶源，这些步骤在反应体系中不断重复， 使靶DNA序列呈指数性增长；37℃ ~40℃进行23次循环 后，2h内靶序列可得到108扩增放大。 SDA法以IS6110和16SrRNA基因为扩增靶点。
所编码的蛋白约有40%的为功能性蛋白，44%的 与已知蛋白有相似性信息，16%的则为未知蛋白。 TB不同菌株之间存在多个差异基因。 基因组中有3个毒力因子：mce、过氧化氢酶-过 氧化物酶和sigA。除了这些单基因毒力因子，细 菌的胞壁也对致病性起着重要的作用。
二、结核分枝杆菌的分子生物学检验内容 （一）结核分枝杆菌核酸的检测
可采用PCR、real-time PCR、PCR-RFLP、线性探针杂 交、链替代扩增技术、扩增结核分枝杆菌直接试验、基 因芯片技术、全自动结核检测平台等方法检测标本中的 TB DNA。 1、 PCR PCR扩增所选靶序列主要有65kD抗原基因、 MPB蛋白基因、rRNA基因、TB IS6110插入序列、染色 体DNA的重复序列等。常规PCR的不足：产物的交叉污 染、假阳性、假阴性、实验室污染。 2、real-time PCR 与传统PCR相比，具有敏感度、特 异性高及方便快速等优点，特别是对难以培养与生长缓 慢的结核杆菌的检测更有优势。
第二节 结核分枝杆菌的分子生物学检验
结核分枝杆菌(TB)，简称结核杆菌，是引起结核 病的病原体。随着抗结核药物的不断发展和卫生 生活状况的改善，结核的发病率和死亡率曾一度 大幅下降。近年，由于艾滋病和结核分枝杆菌耐 药菌株的出现、免疫抑制剂的应用、吸毒、贫困 及人口广泛流动等因素，全球范围内结核病的疫 情死灰复燃。 据WHO统计，全世界约1/3的人感染了结核分枝 杆菌，在某些发展中国家成年人中群中结核分枝 杆菌携带率高达80%，其中的5%~10%携带者可 发展为活动性结核病。
6、扩增结核分枝杆菌直接试验（ AMTDT） AMTDT以结核分枝杆菌的16SrRNA为扩增模板，采 用转录介导的扩增技术对靶核酸进行扩增，采用化 学发光物吖啶酯标记的cDNA探针与扩增的靶基因杂 交，探针与扩增产物杂交后利用杂交保护试验除去 未杂交的标记探针，最后利用化学发光仪检测化学 发光信号。 AMTDT方法具有高度的敏感性特异性。对涂片阳性 TB诊断的敏感性达到92%~100%，对所有临床标本 检测的特异性均在95%以上，因此具有极大的临床 应用价值。
TB具有合成所有必需氨基酸、维生素和酶辅助因 子的潜在能力。该菌具有代谢各种各样碳水化合 物、乙醇、酮和羧酸的能力。此外，还具有许多 涉及脂代谢、糖酵解、磷酸戊糖途径、三羧酸和 乙醛酸循环所必须的酶分子。 TB的培养特点：馋、懒、丑。 馋--营养要求较高，必须在含血清、卵黄、马铃薯、 甘油以及含某些无机盐类的特殊培养基（罗氏） 上才能生长良好。 懒--生长缓慢，14～18h分裂1次，在固体培养基 上2～5w才出现肉眼可见的菌落。 丑--典型菌落为粗糙型，表面干燥呈颗粒状，不透 明，乳白色或淡黄色，如菜花样。
TB H37Rv 基因组中共有3924个开放阅读框，其 中91%有潜在的编码能力，ORF中最常见的起始 密码子61%为ATG，35%为GTG。
187个ORF参与脂类代谢、细胞壁合成， 360个参与细胞壁代谢， 66个参与脂类合成， 287个参与能量代谢， 95个参与氨基酸合成， 38个与细菌毒力相关， 69个参与DNA合成。
7、基因芯片技术、
1999年 Troesch 等开发出首块结核病相关芯片，包括 两部分，一部分是在结核分枝杆菌有种间的多态性的 16SrRNA 基因片段，借以鉴别结核杆菌与非结核杆菌； 另一部分则用于分析耐利福平菌株rpoB基因突变的发 生情况，可用于结核分枝杆菌对利福平耐药性的快速 检测。 8、GeneXpert全自动结核检测平台 将样品前处理、核酸提取、PCR检测和结果分析等全 过程结合在一起，最大程度上提高检测自动化和灵敏 度。XpertMTB/RIF，通过六重荧光定量PCR对结核分 枝杆菌和利福平耐药性进行快速检测。
（3）耐氨基糖苷类药物分子机制：耐链霉菌的结核杆菌 主要由于编码核算糖体16S rRNA的rrs基因与编码核糖体 蛋白S12的rpsL基因发生突变，从而降低了氨基糖苷类药 物结合到核糖体上的能力，形成耐药。 rpsL基因中编码第43位氨基酸的碱基A→G的突变是常见 的突变位点出。Rrs基因突变点为512、513位的碱基插 入，这些碱基突变均可导致高水平的耐药。 （4）耐吡嗪酰胺分子机制：吡嗪酰胺需经结核分枝杆菌 体内的吡嗪酰胺酶催化才能转变成具有活性的吡嗪酸。 耐吡嗪酰胺主要由 pncA 基因突变所造成的吡嗪酰酶的 蛋白结构改变，失去了将吡嗪酰胺转换成活性形式的能 力，形成耐药。
Leabharlann Baidu
结核分枝杆菌天然地对很多抗生素有抵抗力，使得 治疗极其困难。该菌的药物抵抗力主要由于其具有 高度疏水的细胞壁充当渗透屏障。同时，在基因组 中还发现有许多药物抗性决定因子的编码序列，包 括水解酶或者药物修饰酶，例如乙酰转移酶和很多 药物外排泵系统。
抵抗力特点：“三耐四敏” ※耐干燥、耐酸碱、耐孔雀绿（1：13000） ※对湿热、70％乙醇、紫外线、常用抗结核药物（但长 期使用易产生耐药性） 变异性 ※典型形态→多形性 ※ R型菌落→S型菌落 ※有毒→无毒（用于制备疫苗） ※抗结核药敏感→耐药
临床分子生物学检验
第九章
细菌感染的分子生物学检验
湖南省中医药大学生化与分子生物学教研室 Jake Li
细菌感染是致病菌或条件致病菌入侵机体，并在机体 中生长繁殖，产生毒素或其他代谢产物所引起的全身 性感染，临床上以寒战、高热、关节疼痛等为特征， 部分患者还可以出现烦躁、四肢厥冷、发绀、呼吸加 速、血压下降、感染性休克等临床症状。 传统上对于细菌感染的病原体检测主要采用免疫学、 微生物学和血液学等相关技术，但这些技术方法受灵 敏度和特异性的限制，不易达到早期诊断。 利用分子生物学技术检验感染性病原体自身遗传物质 （RNA或DNA），从而达到早期、快速、敏感、特异 地检测已经成为临床检验的主流技术之一。
目前结核杆菌常规检测方法
痰涂片法阳性率低，且易受非结核杆菌的污染。 培养法目前认为是诊断的“金标准”但结核杆菌 生长缓慢，不利于临床上的及时诊断和治疗。 血清学试验由于分枝杆菌属各菌之间抗原有着广 泛的交叉，特异性不强。
一、结核分枝杆菌的基因组结构特征
TB H37Rv 全基因组为环状双链 DNA，长约4 411 529bp，共有 4000基因， G+C平均值65.6%， 其基因序列高度保守。 H37Rv 基因组中有50 个编码功能 RNA 的基因，其中 45 个 tRNA基 因，3 个 rRNA 基因和 2 个核稳定 （stable）RNA基因，这些 RNA 分子是由特异的核糖体RNA 操纵 子产生的。 在H37Rv 全基因组中有16个拷贝的IS6110插入序列和6个 拷贝的IS1018，大多数插入序列位于基因间或非编码区， 通常靠近tRNA基因聚集成串，插入序列在染色体中主要分 布在重复区。
一、细菌感染的一般性检出策略
细菌感染性的分子生物学检验的一般性检出就是以感 染病原体的特异核酸序列作为检测目标序列，利用分 子生物学技术对目标序列进行检测，从而直接判断有 无细菌感染和是何种病原体感染。 二、细菌感染的完整性检出策略 完整性检出策略，即不仅对病原体作出快速准确诊断， 还需要对其进行分型（包括亚型）和耐药性等方面的 检测，尽可能地为临床诊疗提供更为详尽的细菌病原 体的相关信息。