鱼腥草全草中黄酮的提取和含量测定

鱼腥草全草中黄酮的提取和含量测定摘要:以乙醇为溶剂,采用索氏回流法提取鱼腥草全草中的黄酮｡优化了索氏回流法的提取温度､乙醇体积分数､提取时间､固液比等提取条件;索氏回流法的最佳提取条件为提取温度100℃､乙醇体积分数80%､提取时间 4 h､固液比1∶30(m/V,g∶mL,下同),在此条件下,黄酮提取率为12.59%｡采用硝酸铝比色法测定鱼腥草全草中的黄酮含量,结果表明,芦丁浓度在48.75~377.31μg/mL范围内与吸光度呈良好的线性关系(R2=0.999 4);相对标准差RSD为0.21%,加样平均回收率为99.10%,表明该方法重复性良好,结果稳定可靠｡关键词:鱼腥草全草;黄酮;索氏提取法;紫外分光Content Determination of Flavonoid in Whole Plants of Houttuynia cordata Abstract:Taking the whole plant of Houttuynia cordata Thunb. as the raw material, ethanol as solvent extraction, Soxhlet extraction method was used to extract flavonoid. The elements such as extraction temperature, ethanol concentration, extraction time, solid-liquid ratio which affected the yield of flavonoid from whole plants of H. cordata were investigated by orthogonal experiment. Content of flavonoid was determined by Al(NO3)3 colorimetry.The results showed that absorption had good linear relationship with rutin concentration at the range of 48.75~377.31μg/mL(R2=0.999 4). RSD was 0.21%, indicating good repetitiveness. The average recovery rate was 99.10%, it showed that the method was stable and reliable. The optimal conditions were as follows: extraction temperature at 100℃,ethanol concentration of 80%, extraction time 3 h, solid-liquid ratio 1∶30. The yield was 12.59% under these conditions.Key words: Houttuynia cordata Thunb whole plant; flavonoids; soxhlet extraction method; spectrophotometry鱼腥草(Houttuynia cordata Thunb.)为三白草科一年生草本植物,始载于《名医别录》,自古以来供食药两用[1],现被国家卫生部正式确定为“既是食品,又是药品”,极具开发价值[2-4]｡紫赤色,易于种植,肥地能蔓生,多生长在湿地山谷阴处｡黄酮类化合物(Flavonoids)是经植物光合作用产生的一大类化合物[5,6],它广泛存在于药用植物､水果和蔬菜中,特别是高等植物的花､叶､根中较多[7]｡黄酮具有广泛的生理活性,如抗氧化､抗癌､防治心脑血管疾病､防治糖尿病､抗菌､抗病毒､抗过敏､祛痰､平喘､抑制消化道疾病､保肝等作用｡植物体内的黄酮的提取主要采用溶剂法､微波法､超声波提取法和超临界流体萃取法等｡科研工作者对黄酮的提取做了大量的工作[8-14]｡黄酮类化合物的提取主要采用热水浸提法,由于黄酮类化p1材料与方法1.1材料与试剂供试材料:鱼腥草全草(于2010年4月中旬采于湖南省永州市零陵区),自然风干备用｡供试试剂:芦丁标准品(中国药品生物制品检定所);无水乙醇､硝酸铝､亚硝酸钠､氢氧化钠等均为国产分析纯｡1.2仪器UV-752紫外分光光度计(上海光谱仪器有限公司),AL104电子天平(Mettler Toledo仪器公司),DF-101S集热恒温磁力搅拌器(郑州长城科工贸有限公司),索式提取器｡1.3鱼腥草中黄酮提取条件的优化取风干后的鱼腥草全草,切碎,放入去离子水中浸泡0.5 h,沸水中煮沸5 min,用清水漂洗数次,洗至沥液接近无色为止,沥干,置烘箱(70℃左右)中烘干,碾碎成粉末状｡准确称取4.0 g经预处理的鱼腥草全草,置于索式提取器的回流管中｡在磁力搅拌器下,以乙醇为溶剂,选择不同提取温度､提取时间､乙醇浓度和固液比为参试因子,以总黄酮的提取量为衡量指标,采用L9(34)正交试验设计表布置试验,以确定鱼腥草中黄酮最佳提取工艺,各因素水平如表1｡所得提取液经过滤,即得到黄酮浸提液｡抽滤,得到黄酮滤液及滤渣｡将滤渣注入到相同体积的､已预冷的甲醇溶液中,静置,得到甲醇-黄酮混合物｡将所得黄酮滤液和甲醇-黄酮混合物进行抽滤,打散滤饼,用95%乙醇溶液洗涤,再抽滤,再打散滤饼,最后用无水乙醇洗涤脱水,得到黄酮提取液｡1.4鱼腥草中黄酮含量的测定1.4.1溶液的制备标准品溶液:取120℃真空干燥至恒重的芦丁标准品约50 mg,精密称定,置于50 mL容量瓶中,加60%乙醇适量,水浴上微热,使溶解,放冷后用60%乙醇稀释至刻度,摇匀｡样品溶液:准确称取干燥鱼腥草叶粉末4 g,加入120 mL 80%的乙醇溶液,在100℃下回流提取3 h,冷却､过滤,共提取3次,合并滤液并定容至200 mL,得测定用样液｡1 mol/L NaOH溶液:准确称取4.000 0 g NaOH固体,用去离子水溶解定容于100 mL的容量瓶中｡NaNO2溶液(1∶20):准确称取5.000 0 g NaNO2,用去离子水溶解定容于100 mL的容量瓶中｡Al(NO3)3溶液(1∶10):准确称取10.000 0 g Al(NO3)3,用去离子水溶解定容于100 mL的容量瓶中｡1.4.2标准曲线的绘制吸取标准品溶液0.0,1.0,2.0,3.0,4.0及5.0 mL,分别置于50 mL容量瓶中,各加60%乙醇使其成为5.0 mL｡加入NaNO2溶液(1∶20)0.5 mL,摇匀,放置6 min后;加Al(NO3)3溶液(1∶10)1.5 mL,摇匀,放置6 min;加1.0 mol/L NaOH试液4.0 mL,去离子水稀释至刻度,摇匀,放置15 min｡在510 nm波长下测定各溶液的吸光度｡以浓度为横坐标,吸光度为纵坐标,绘制标准曲线｡1.4.3样品稳定性试验制备样品溶液,吸取2.0 mL显色剂,比色溶液显色后,每隔5 min测定其吸光度,共测定2 h｡1.4.4重复性试验分别量取5.0 mL样品溶液5份,测定其吸光度,计算平均值,标准差及相对标准差｡1.4.5加样回收率试验准确吸取芦丁标准溶液0.10､0.15､0.20 mL各两份分别于6个25 mL容量瓶中,各加入1.00 mL稀释至一定浓度的测定用样品样液,测定其吸光度,通过标准曲线计算样品中黄酮含量,测定回收率｡1.4.6黄酮提取率的计算1)黄酮提取率计算公式为:黄酮提取率(%)=[C×V×10×10-6/m]×100式中,C——从标准曲线查得的黄酮浓度(μg/mL);V——提取的浓缩液体积(mL);m——样品质量(g);10-6——将μg/mL换算的系数｡2)黄酮含量计算公式为:黄酮含量=C×V×10×10-6式中,C——从标准曲线查得的黄酮浓度(μg/mL);V——提取的浓缩液体积(mL);10-6——将μg/mL换算的系数｡2结果与分析2.1正交试验结果由L9(34)正交试验结果(表2)可知,各单因素对于鱼腥草全草中黄酮提取率的影响次序为A>B>D>C,即提取温度>乙醇体积分数>固液比>提取时间｡因此在该试验条件下,以乙醇为溶剂采用索式回流的方法提取黄酮的最佳条件是:提取温度100℃,乙醇体积分数80%,提取时间4 h,固液比1∶30｡按此条件进行6次验证试验,黄酮的平均提取率为12.59%｡2.2黄酮含量测定方法的确定2.1.1标准曲线的绘制测定溶液的吸光度,以浓度为横坐标,吸光度为纵坐标,绘制标准曲线｡结果表明,芦丁浓度在48.75~377.31 μg/mL范围内与吸光度呈良好的线性关系,回归方程为A=0.972 4C+0.011 1,R2=0.999 4(图1)｡2.1.2稳定性试验样品溶液在显色后15~45 min内,吸光度变化小于5%｡此后随着时间的延长,吸光度下降明显,说明该试验显色是稳定的,样品测定应在显色后15~45 min内完成｡2.1.3重复性试验重复性试验结果表明,该测定方法的相对标准差是0.21%,说明该方法的重复性良好｡2.1.4加样回收率试验准确吸取芦丁标准溶液0.10､0.15､0.20 mL各两份分别于6个25 mL容量瓶中, 各加入1.00 mL稀释至一定浓度的测定用样液,测定回收率｡结果见表3｡从结果中得出加样平均回收率为99.10%｡表明该试验方法测定结果稳定可靠｡3小结与讨论同传统提取方法相比,索式回流方法是利用溶剂的回流和虹吸原理｡随着提取温度升高,回流不断的发生,这样大大地缩短了提取时间｡以乙醇为溶剂采用索式回流对液固物质中所需成分进行连续提取,溶剂能反复利用,这样就节约了大量的溶剂｡随着提取时间的缩短,溶剂也相应地减少,萃取出来的样品也相应地提高｡正交试验结果表明,以乙醇为溶剂采用索式回流提取黄酮的最佳工艺条件为:提取温度为100℃,乙醇体积分数为80%,提取时间为4 h,固液比为1∶30｡上述条件下所得黄酮平均提取率为12.59%｡药用植物中黄酮的定量检测常用高效液相色谱法和分光光度法｡对于黄酮单体的定量检测常采用前者,而对于总黄酮的测定,考虑到方法的快速､简便和可行性等,多采用硝酸铝分光光度法｡该试验中,笔者参照相关文献[18]芦丁提取条件,采用硝酸铝比色法[19]在波长510 nm处测定样品溶液的吸光度｡结果表明,芦丁浓度在48.75~377.31 μg/mL范围内与吸光度呈良好的线性关系(R2=0.999 4);其相对标准差为0.21%,重复性良好;加样平均回收率为99.10%,表明该方法测定结果稳定可靠｡因此,该试验设定的技术参数和方法适用于鱼腥草全草中黄酮的定量分析｡黄酮含量的测定结果表明,鱼腥草全草中含有丰富的黄酮类化合物,且其资源丰富,药理作用广泛,有着良好的开发应用前景｡通过黄酮的提取率和黄酮含量的测定可知,改进的工艺优于常规工艺｡参考文献:[1] 廖德胜,王敬勉.鱼腥草黄酮的制备及其应用研究[J].中国食品添加剂,2002(2):81-83.[2] 吴佩颖,徐莲英,陶建生.鱼腥草的研究进展[J].上海中医药杂志,2006,40(3):62-64.[3] 魏秀俭,郭彦,时明芝,等.绿色食药明球——鱼腥草[J].中国食物与营养,2006(1):56-57.[4] 胡凤莲,倪细炉,刘文哲. 鱼腥草中总黄酮和槲皮素含量的动态变化[J]. 安徽农业科学,2008,36(10):4128-4130.[5] 陈业高.植物化学成分[M].北京:化学工业出版社,2004.[6] 张睿,徐雅琴,时阳.黄酮类化合物提取工艺研究[J].食品与机械,2003(1):21-28.[7] 刘玉芬,夏海涛,杨树平.紫外分光光度法测定剑麻花中总黄酮含量[J].食品科学,2005,26(9):418-422.[8] 胡敏,张艳红,胡艳.银杏黄酮甙的水浸提方法研究[J].食品与发酵工业,1997,24(4):31-34.[9] 丁利君,吴振辉,蔡创海,等. 菊花中黄酮类物质提取方法的研究[J].食品工业科技,2002,23(2):20-22.[10] 王兰珍,马希汉,王妹清,等.元宝枫叶总黄酮提取方法研究[J].西北林学院学报,1997,12(4):64-67.[11] 范志刚,麦军利,杨莉斌,等.微波技术对雪莲中黄酮浸出量影响的研究[J].中国民族医药杂志,2000,6(1):43-44.[12] 何熹,韩宁. 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