蛋白纯化-Ni亲和层析柱法

Ni亲和层析柱法纯化带组氨酸标签的重组蛋白

纯化设备：

纯化仪：ÄKTA purifier(GE Healthcare, Uppsala, Sweden)

Ni亲和层析柱：HisTrap TM HP-5 mL (GE Healthcare, , Uppsala, Sweden)

试剂：

所有上柱的试剂均需经µM孔径过滤器过滤并超声波震荡除气处理方可使用。

Binding Buffer：20 mM Na2HPO4-NaH2PO4, pH , 500 mM NaCl, 5 mM 咪唑

Elution Buffer：20 mM Na2HPO4-NaH2PO4, pH , 500 mM NaCl, 500 mM 咪唑

Stripping Buffer: 20 mM Na2HPO4-NaH2PO4, pH , 500 mM NaCl, 50 mM EDTA

20%乙醇：200 mL无水乙醇，加蒸馏水定容至1L

NiSO4: 称取 NiSO4·6H2O，加蒸馏水溶解，定容至100 mL

操作步骤：

1 样品前处理

取诱导后菌液50 mL，4℃、5000 rpmin离心10 min收集菌体，以25 mL Binding Buffer 重悬菌体，冰浴下超声波破碎至澄清，4℃、12000 rpmin离心25 min，取上清，经µM孔径过滤器过滤后待用。

2 Ni柱前处理

上样前，使用10倍柱体积的Binding Buffer以5 mL/min的流速平衡镍柱。

3 上样

经离心、过滤处理后的样品以1 mL/min的流速通过衡流泵加载到平衡后的Ni柱上，收集穿透液，可反复上样以提高样品的挂柱效率。

4 平衡上样后的Ni柱

将已结合目的蛋白的Ni柱回接到ÄKTA purifier上，用10倍柱体积的Binding Buffer 以5 mL/min的流速再次平衡镍柱以去除未结合上的蛋白。

5 梯度洗脱

以梯度的Elution Buffer/Binding Buffer混合液洗脱Ni柱(梯度的界定因蛋白而不同，可经预实验确定)，流速为 5 mL/min，并监测OD280值，收集蛋白吸收峰对应的洗脱液，经

SDS-PAGE检测后确定目的蛋白所在。

6 Ni柱的清洁及保存

以10个柱体积的Elution Buffer彻底洗脱Ni柱，除去残余的柱结合蛋白；而后用5-10个柱体积的20% 乙醇平衡Ni柱；取下Ni柱，于室温下保存。

7 关闭纯化系统及电脑

8 Ni柱的彻底清洗及再生

对使用过的Ni柱进行彻底清洗并再生后方可用于其他蛋白样品的纯化。

Ni的剥离(Stripping)

A 5-10个柱体积的Stripping Buffer洗脱Ni柱，剥离Ni离子

B(可选) 若Ni柱因非特异性结合杂蛋白的沉积而难以仅通过剥离Ni而彻底清洁时，可采用

1 M NaOH洗脱Ni柱1-2h以除去杂蛋白。

C 5-10个柱体积的Binding Buffer洗脱Ni柱

D 5-10个柱体积的蒸馏水洗脱Ni柱

Ni柱再生(Recharging)

A 用 mL的 M NiSO4洗脱上述Ni柱

B 用5个柱体积的蒸馏水洗脱Ni柱

C 用5个柱体积的Binding Buffer平衡Ni柱

9Ni柱保存

将Ni柱保存在20%的乙醇中，即以5-10个体积的20%乙醇平衡Ni柱