细胞周期和细胞凋亡
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Cell number
s
G0/G1
s
0 200 400 600
G2 /M
800 1000
4N 2N DNA content
DNA Analysis
300
Counts
75
150
225
0
0
200
400
600
800
1000
2N
4N
PI Fluorescence
应用FCM进行细胞凋亡定量检测
——单参数分析 PI 染色法
DNA含量
• Annexin V - PI 的双染色法检测细胞 凋亡原理：
结合
Annexin V
质膜
磷脂酰丝氨酸
新月状
八字形
花瓣状
环状
眼球状
黑洞样
细胞核断裂成碎片
染色质浓缩，形成多种形态
凋亡小体形成
凋亡早期细胞
凋亡小体迅速 被巨噬细胞吞 噬
上皮细胞
被巨噬细胞吞 噬的凋亡小体 巨噬细胞
图：细胞凋亡时超微结构的变化
由膜包裹的凋亡小体
细 胞 膜 向 外 突 起 细 胞 核 破 裂
染 色 质 浓 缩
形 成 凋 亡 小 体
DNA ladder
（2）Bcl-2蛋白家族成员及生物学效应
Bcl-xl、Bcl-xs、Bax、Bad和线虫的ced9等（共同具有BH1和BH2两个保守区域） Bax：诱导凋亡，以同源二聚体形式存在， 也可与Bcl-2形成异源二聚体 Bcl-xl、Bcl-xs：由bcl-x基因通过mRNA 不同剪切形成， Bcl-xl抑制凋亡， Bcl-xs 促进凋亡
流式细胞仪与显微镜
FLOW
光源 激光 细胞、生物粒子 *鞘液及流动室 光学信号 PMT，放大电路 计算机，>5000 多参数，综合分析
MICROSCOPE
自然光、灯光、氙(汞)灯
细胞、生物粒子 载(盖)玻片 形态及染色 目镜X物镜, 光学放大 人工，200 简单，单参数
对象
承载工具 检测信号 放大方式 统计 结果
细胞凋亡与坏死的区别
特征 细胞形状 细胞凋亡 细胞皱缩 细胞坏死 细胞肿胀、溶解 不能保持 肿胀、破裂
膜的完整性 能保持 细胞器 结构完整
染色质
浓缩
分解
弥漫性降解
细胞核生化 DNA片段 改变 化
二、细胞凋亡的检测方法
特性 推荐使用手段 说明
形态学 细胞表面改变 扫描电镜 微绒毛消失,芽状突起,可见凋亡小体 胞浆改变 相差显微镜 细胞皱缩,质膜变形,胞浆空泡 染色质凝聚核裂解相差显微镜或光镜 适用于组织切片 荧光显微镜 用结合DNA的染料标记,适用于培养细胞 流式细胞仪 定量测定DNA含量,细胞的大小和蛋白,适于 培养细胞 超微结构 透射电镜 完整的细胞器,胞浆空泡,核染色质凝聚裂解, 凋亡小体适用于组织切片或培养细胞 生化改变 DNA裂解 琼脂糖凝胶电泳 梯状条带 磁场反转凝胶电泳 可测50bp或300bp的HMW片段 TUNEL法 原位缺口平移法 基因表达 可从mRNA、蛋白层次测定，可用免疫组化、 原位杂交、Northern印迹法等
Bcl-2、 Bax和Bcl-xs三者形成一个凋亡 调控系统
（1）当Bax同源二聚体形成，便诱导凋亡 （2）随Bcl-2蛋白表达量上升， Bax二聚体分开， 与Bcl-2形成比Bax –Bax更稳定的Bax - Bcl-2异 源二聚体 （3）当Bcl-xs存在时，优先与Bcl-2形成异源二 聚体，使游离的Bax形成同源二聚体诱导凋亡。
1、透射电镜形态学观察法
收集细胞→PBS洗两遍→戊二醛固定→电镜切片
形态特点：
细胞膜起泡、出芽，染色体凝集，形成的凋亡小体。
缺点：
①只能定性不能定量 ②标本处理过程复杂、设备昂贵，不适合作大批标本 检测
2、扫描电镜形态学观察法
主要观察细胞表面的结构变化
正常的肝癌细胞
凋亡的肝癌细胞 表面微绒毛消失
Bad、 Bax和 Bcl-xl三者可形成一个凋 亡调控系统
Bad：诱导凋亡，能和Bcl-2或 Bcl-xl形 成二聚体 Bad与Bcl-xl形成稳定的异二聚体后，使 原来的的Bax- Bcl-xl解体，将Bax置换出 来，形成Bax同源二聚体，启动凋亡。
AO和EB双染
正常细胞： AO－ 绿色荧光强， EB－ 染色红色荧光较弱； 凋亡细胞： AO－ 绿色荧光强度弱减， EB－ 染色红色荧光加强； 坏死细胞： AO－ 绿色荧光强度弱或消失 EB－ 染色红色荧光强
②细胞不需固定，省时省力。
③结果更可靠。
注意：胰酶的消化时间
三、凋亡调控基因及凋亡相关因子的检测
㈠与细胞凋亡有关的基因和相关因子
1.生存基因（死亡抑制基因） ①促进细胞存活的基因： bcl-2基因家族： 主要功能：延长细胞的寿命，对细胞周期和分化
不产生影响；抑制多种模型的细胞凋亡。
存在部位：bcl-2蛋白主要定位在核膜、
ER膜、mi膜上。
②促进细胞增殖的基因
如：c-myc、c-abl、ras相关基因
2.死亡基因
(1)促进细胞死亡的基因 caspase基因家族： Bax基因：Bax过度表达，可拮抗bcl-2的 促进细胞增殖作用及抑制程序性细胞死 亡。
⑵抑制细胞生长的基因: P53基因、Rb基因
(二)凋亡调控基因和因子的检测方法
侧向散射光
侧向散射光
前向散射光（FSC）：检测细胞大小 侧向散射光（SSC）：检测细胞内部结构 （胞浆内颗粒多少, 核质比）
根锯FSC/SSC，就可以分开全血样本中的淋巴 细胞，单核细胞和中性粒细胞。
620BP FL3 (PI) 575BP FL2 (PE) 525BP FL1 (FITC)
Laser Side Scatter Detector
用途
免疫荧光 免疫荧光
颜色
绿色 橙色
ECD
PeCy5 PI PECy7 PerCP
488
488 488 488 488
620
675 620 755 670
Байду номын сангаас
免疫荧光
免疫荧光 DNA染色 免疫荧光
橙红
红 橙红 深红
APC
633
670
分 选 原 理
超高频电晶体充电后振动→液流断裂为均匀的液滴→ 将液滴充以 正负不同的电荷→当液滴流经带有几千伏特的偏转板时，在高压电 场的作用下偏转→落入各自的收集容器中，不予充电的液滴落入中 间的废液容器，从而实现细胞的分离。
坏死细胞
P I
活细胞
FITC
凋亡细胞
AnnexinV / PI的双染色法：
左下象限显示正常活细胞，为FITC- / PI-；
右上象限为坏死细胞，为FITC+ / PI+；
右下象限为凋亡细胞，呈现FITC+ / PI-
AnnexinV / PI的双染色法检测凋亡细胞
• 优点： ①对早期凋亡细胞检测灵敏
以荧光探针PI（碘化丙锭）、吖啶橙等特异
性染料标记细胞的DNA和RNA ，通过观察这些
成分的含量变化来区分凋亡细胞。
PI染色后，由于凋亡细胞的DNA含量低于正
常的二倍体含量，会在二倍体峰前出现一个亚二
倍体峰（Sub-G1峰、凋亡峰、AP峰）。可根据
此峰的面积计算凋亡细胞的百分率。
区分细胞碎片和凋亡细胞
注:鞘液是指无细胞的磷酸缓冲液
基 本 原 理
待测单细胞悬液细胞（染色后）→压入流动 室→鞘液在高压下从鞘液管喷出→鞘液包绕 着样品高速流动，使细胞排列成较稳定的单 细胞队列→激光垂直照射在样品流上，使被 染色的细胞在激光束的照射下产生散射光和 激发荧光→ 散射光和荧光分别被光电二极管 和光电倍增管接收→转换成电压脉冲和积分 脉冲→信号经模 - 数转换后进入计算机
或关的“阀门”，即限制点（亦称为检验点）。
G20
G2 M S G1 G1B
（控制细胞从G1A态转 为G1B态的临界点）
G1D G0
S0
R
１.G1期细胞的生长
合成三种RNA 核糖体的组装
结构蛋白 酶蛋白的合成
ＮＰ ＝
（核质比）
细胞核体积 细胞质体积
＝
Ｖn Vc－Vn
＝0.3 ~ 0.5
2. G1期细胞的增殖状态
细胞DNA分析原理
利用特殊的荧光染料(PI、EB、AO等) 与细胞内DNA碱基结合，被荧光染料染色的 细胞在激光照射下发射出荧光，荧光强度 与DNA含量成正比。流式细胞仪通过测定细 胞的荧光强度推算出细胞的DNA含量。
Normal Cell Cycle
G2 M
G1 G0
DNA Analysis
增殖细胞群(A) 暂不增殖细胞群(B) 不再增殖细胞群(C)
衡量一个肿瘤细胞群体的增殖速率的动 力学参数主要为:
肿瘤的生长分数 GF= 肿瘤群体细胞总数 (增殖率) A 增殖细胞数
=
A+B+C
第二节 细胞凋亡技术
细胞凋亡（apoptosis）
多细胞有机体为调控机体发育，维护内环 境稳定，由基因控制的细胞主动死亡过程。
675BP FL4 (PC5)
645DL 600DL 550DL
Beam Shaping Lenses
Flow Cell
488BK 488DL
Forward Scatter Detector
荧光检测器
常用荧光染料的特性
荧光染料 激发波长 (nm) 发射波长(nm)
FITC PE(RD1) 488 488 525 575
凋亡的细胞核因核浓缩而具有高SSC值，因 此很容易与低SSC值的碎片的相区别； 凋亡的细胞核的荧光的信道值为10~250， 而碎片的信道值一般为1~5，因此可以将PI 荧光的设定在10信道上，从而去掉碎片。
优点： 快速准确，简单易行，所需样本少，可 做大批量、定量凋亡标本的检测。 缺点：
增殖细胞群
暂不增殖细胞群 G1期细胞类型
(保持着增殖能力但处于休止状态）
永不增殖细胞群
增殖 细胞群
G1D G０
永不增殖细胞群 暂不增殖细胞群
死亡
(二) S期: 合成DNA
(三) G2期:
为M期的细胞分裂作好物质和能量贮备
(四)M期
把复制好的染色体平均地分到两个子细
胞中去
二. 细胞增殖与肿瘤
肿瘤的群体类型
不能区别坏死细胞和凋亡细胞
注意事项：1、单细胞悬液（100万）
2、固定时防止细胞成团
3、低温避光孵育
双参数分析 双参数分析：应用两种荧光染料标记细 胞的成分。
例：Annexin V - PI 的双染色法。 Annexin Ⅴ是一种分子量为35-36kD的Ca2+依赖 性磷脂结合蛋白，能与细胞凋亡过程中翻转到膜 外的磷脂酰丝氨酸（Phosphatidylserine，PS） 高亲和力特异性结合。以标记了FITC的 AnnexinⅤ作为荧光探针，利用流式细胞仪可检测 细胞凋亡的发生。将Annexin Ⅴ与PI匹配使用， 可以将凋亡早期的细胞和晚期的细胞以及死细胞 区分开来。
细胞周期和细胞 凋亡技术
第一节 细胞增殖周期
一、细胞周期概述 细胞周期: 细胞从一次分裂结束开始到 下一次分裂结束为止所经历的过程
G2 M S G 1
G1期（DNA合成前期） 间期 S 期（DNA合成期） G２期（DNA合成后期） 细胞周期 前期 有丝分裂期（M期） 中期 后期 末期
M G2 S G1
又称为程序性死亡
（programmed cell death, PCD）
一.细胞凋亡的特征
形态学特征： 细胞膜向外突起，细胞体积缩小 ↓ 染色质凝缩，然后断裂成碎片 ↓
形成数个大小不等的由膜包裹的凋亡小体
↓ 凋亡小体被邻近细胞吞噬
（2）细胞坏死（necrosis）
概念：细胞受到激烈的物理、化学刺激或 严重的病理性刺激后，引起的细胞损伤和 死亡。 特征：胞膜通透性增高，使细胞肿胀，细 胞器变形或肿大，细胞核破碎，最后细胞 溶解破裂，溶酶体泄漏，引起炎症反应。
1、免疫组织化学方法
适用于冰冻或石蜡包埋的标本
2、流式细胞术
可检测细胞悬液或培养细胞中荧光标记的凋亡
相关的基因产物
3、RT-PCR法检测凋亡调控基因的mRNA表达
4、基因芯片
思考题
1、简述细胞凋亡的分子机制（可以选择三 种通路其中一种） 2、简述检测细胞凋亡最新的几种方法。
前向散射光
凋亡细胞表面有 众多凋亡小体
3、流 式 细 胞 分 析 仪
（Flow Cytometry，FCM）
概念：
流式细胞仪是将流体喷射技术、激光技 术、空气计数、γ-射线能谱术及电子计算机 等技术与显微荧光光度计结合的一种大型的 精密仪器，它通过测量在一定波长的激光激 发快速流动的粒子（细胞或微粒）荧光和散 射激光来获得粒子的一些成分及其变化情况， 进行多参数的、快速的定量分析和分选的技 术。 FCM应用标志着细胞学、肿瘤学、免疫 学等进入了细胞和分子水平的研究。
Tc=TG1+TS+TG2+TM
细 胞 周 期 室
S0
G20 G2
ST
M
S
G1A态: 染色质螺旋化程度较高，RNA含量较少
G1B态: 染色质螺旋化程度较低，RNA含量较多
:
G1
G1B
G1D (分化态)
G1T
ST
G0 (静止态)
二、细胞周期各时相的特点
(一) G1期
限制点( R点) :在G1期存在一个调节细胞周期的开
s
G0/G1
s
0 200 400 600
G2 /M
800 1000
4N 2N DNA content
DNA Analysis
300
Counts
75
150
225
0
0
200
400
600
800
1000
2N
4N
PI Fluorescence
应用FCM进行细胞凋亡定量检测
——单参数分析 PI 染色法
DNA含量
• Annexin V - PI 的双染色法检测细胞 凋亡原理：
结合
Annexin V
质膜
磷脂酰丝氨酸
新月状
八字形
花瓣状
环状
眼球状
黑洞样
细胞核断裂成碎片
染色质浓缩，形成多种形态
凋亡小体形成
凋亡早期细胞
凋亡小体迅速 被巨噬细胞吞 噬
上皮细胞
被巨噬细胞吞 噬的凋亡小体 巨噬细胞
图：细胞凋亡时超微结构的变化
由膜包裹的凋亡小体
细 胞 膜 向 外 突 起 细 胞 核 破 裂
染 色 质 浓 缩
形 成 凋 亡 小 体
DNA ladder
（2）Bcl-2蛋白家族成员及生物学效应
Bcl-xl、Bcl-xs、Bax、Bad和线虫的ced9等（共同具有BH1和BH2两个保守区域） Bax：诱导凋亡，以同源二聚体形式存在， 也可与Bcl-2形成异源二聚体 Bcl-xl、Bcl-xs：由bcl-x基因通过mRNA 不同剪切形成， Bcl-xl抑制凋亡， Bcl-xs 促进凋亡
流式细胞仪与显微镜
FLOW
光源 激光 细胞、生物粒子 *鞘液及流动室 光学信号 PMT，放大电路 计算机，>5000 多参数，综合分析
MICROSCOPE
自然光、灯光、氙(汞)灯
细胞、生物粒子 载(盖)玻片 形态及染色 目镜X物镜, 光学放大 人工，200 简单，单参数
对象
承载工具 检测信号 放大方式 统计 结果
细胞凋亡与坏死的区别
特征 细胞形状 细胞凋亡 细胞皱缩 细胞坏死 细胞肿胀、溶解 不能保持 肿胀、破裂
膜的完整性 能保持 细胞器 结构完整
染色质
浓缩
分解
弥漫性降解
细胞核生化 DNA片段 改变 化
二、细胞凋亡的检测方法
特性 推荐使用手段 说明
形态学 细胞表面改变 扫描电镜 微绒毛消失,芽状突起,可见凋亡小体 胞浆改变 相差显微镜 细胞皱缩,质膜变形,胞浆空泡 染色质凝聚核裂解相差显微镜或光镜 适用于组织切片 荧光显微镜 用结合DNA的染料标记,适用于培养细胞 流式细胞仪 定量测定DNA含量,细胞的大小和蛋白,适于 培养细胞 超微结构 透射电镜 完整的细胞器,胞浆空泡,核染色质凝聚裂解, 凋亡小体适用于组织切片或培养细胞 生化改变 DNA裂解 琼脂糖凝胶电泳 梯状条带 磁场反转凝胶电泳 可测50bp或300bp的HMW片段 TUNEL法 原位缺口平移法 基因表达 可从mRNA、蛋白层次测定，可用免疫组化、 原位杂交、Northern印迹法等
Bcl-2、 Bax和Bcl-xs三者形成一个凋亡 调控系统
（1）当Bax同源二聚体形成，便诱导凋亡 （2）随Bcl-2蛋白表达量上升， Bax二聚体分开， 与Bcl-2形成比Bax –Bax更稳定的Bax - Bcl-2异 源二聚体 （3）当Bcl-xs存在时，优先与Bcl-2形成异源二 聚体，使游离的Bax形成同源二聚体诱导凋亡。
1、透射电镜形态学观察法
收集细胞→PBS洗两遍→戊二醛固定→电镜切片
形态特点：
细胞膜起泡、出芽，染色体凝集，形成的凋亡小体。
缺点：
①只能定性不能定量 ②标本处理过程复杂、设备昂贵，不适合作大批标本 检测
2、扫描电镜形态学观察法
主要观察细胞表面的结构变化
正常的肝癌细胞
凋亡的肝癌细胞 表面微绒毛消失
Bad、 Bax和 Bcl-xl三者可形成一个凋 亡调控系统
Bad：诱导凋亡，能和Bcl-2或 Bcl-xl形 成二聚体 Bad与Bcl-xl形成稳定的异二聚体后，使 原来的的Bax- Bcl-xl解体，将Bax置换出 来，形成Bax同源二聚体，启动凋亡。
AO和EB双染
正常细胞： AO－ 绿色荧光强， EB－ 染色红色荧光较弱； 凋亡细胞： AO－ 绿色荧光强度弱减， EB－ 染色红色荧光加强； 坏死细胞： AO－ 绿色荧光强度弱或消失 EB－ 染色红色荧光强
②细胞不需固定，省时省力。
③结果更可靠。
注意：胰酶的消化时间
三、凋亡调控基因及凋亡相关因子的检测
㈠与细胞凋亡有关的基因和相关因子
1.生存基因（死亡抑制基因） ①促进细胞存活的基因： bcl-2基因家族： 主要功能：延长细胞的寿命，对细胞周期和分化
不产生影响；抑制多种模型的细胞凋亡。
存在部位：bcl-2蛋白主要定位在核膜、
ER膜、mi膜上。
②促进细胞增殖的基因
如：c-myc、c-abl、ras相关基因
2.死亡基因
(1)促进细胞死亡的基因 caspase基因家族： Bax基因：Bax过度表达，可拮抗bcl-2的 促进细胞增殖作用及抑制程序性细胞死 亡。
⑵抑制细胞生长的基因: P53基因、Rb基因
(二)凋亡调控基因和因子的检测方法
侧向散射光
侧向散射光
前向散射光（FSC）：检测细胞大小 侧向散射光（SSC）：检测细胞内部结构 （胞浆内颗粒多少, 核质比）
根锯FSC/SSC，就可以分开全血样本中的淋巴 细胞，单核细胞和中性粒细胞。
620BP FL3 (PI) 575BP FL2 (PE) 525BP FL1 (FITC)
Laser Side Scatter Detector
用途
免疫荧光 免疫荧光
颜色
绿色 橙色
ECD
PeCy5 PI PECy7 PerCP
488
488 488 488 488
620
675 620 755 670
Байду номын сангаас
免疫荧光
免疫荧光 DNA染色 免疫荧光
橙红
红 橙红 深红
APC
633
670
分 选 原 理
超高频电晶体充电后振动→液流断裂为均匀的液滴→ 将液滴充以 正负不同的电荷→当液滴流经带有几千伏特的偏转板时，在高压电 场的作用下偏转→落入各自的收集容器中，不予充电的液滴落入中 间的废液容器，从而实现细胞的分离。
坏死细胞
P I
活细胞
FITC
凋亡细胞
AnnexinV / PI的双染色法：
左下象限显示正常活细胞，为FITC- / PI-；
右上象限为坏死细胞，为FITC+ / PI+；
右下象限为凋亡细胞，呈现FITC+ / PI-
AnnexinV / PI的双染色法检测凋亡细胞
• 优点： ①对早期凋亡细胞检测灵敏
以荧光探针PI（碘化丙锭）、吖啶橙等特异
性染料标记细胞的DNA和RNA ，通过观察这些
成分的含量变化来区分凋亡细胞。
PI染色后，由于凋亡细胞的DNA含量低于正
常的二倍体含量，会在二倍体峰前出现一个亚二
倍体峰（Sub-G1峰、凋亡峰、AP峰）。可根据
此峰的面积计算凋亡细胞的百分率。
区分细胞碎片和凋亡细胞
注:鞘液是指无细胞的磷酸缓冲液
基 本 原 理
待测单细胞悬液细胞（染色后）→压入流动 室→鞘液在高压下从鞘液管喷出→鞘液包绕 着样品高速流动，使细胞排列成较稳定的单 细胞队列→激光垂直照射在样品流上，使被 染色的细胞在激光束的照射下产生散射光和 激发荧光→ 散射光和荧光分别被光电二极管 和光电倍增管接收→转换成电压脉冲和积分 脉冲→信号经模 - 数转换后进入计算机
或关的“阀门”，即限制点（亦称为检验点）。
G20
G2 M S G1 G1B
（控制细胞从G1A态转 为G1B态的临界点）
G1D G0
S0
R
１.G1期细胞的生长
合成三种RNA 核糖体的组装
结构蛋白 酶蛋白的合成
ＮＰ ＝
（核质比）
细胞核体积 细胞质体积
＝
Ｖn Vc－Vn
＝0.3 ~ 0.5
2. G1期细胞的增殖状态
细胞DNA分析原理
利用特殊的荧光染料(PI、EB、AO等) 与细胞内DNA碱基结合，被荧光染料染色的 细胞在激光照射下发射出荧光，荧光强度 与DNA含量成正比。流式细胞仪通过测定细 胞的荧光强度推算出细胞的DNA含量。
Normal Cell Cycle
G2 M
G1 G0
DNA Analysis
增殖细胞群(A) 暂不增殖细胞群(B) 不再增殖细胞群(C)
衡量一个肿瘤细胞群体的增殖速率的动 力学参数主要为:
肿瘤的生长分数 GF= 肿瘤群体细胞总数 (增殖率) A 增殖细胞数
=
A+B+C
第二节 细胞凋亡技术
细胞凋亡（apoptosis）
多细胞有机体为调控机体发育，维护内环 境稳定，由基因控制的细胞主动死亡过程。
675BP FL4 (PC5)
645DL 600DL 550DL
Beam Shaping Lenses
Flow Cell
488BK 488DL
Forward Scatter Detector
荧光检测器
常用荧光染料的特性
荧光染料 激发波长 (nm) 发射波长(nm)
FITC PE(RD1) 488 488 525 575
凋亡的细胞核因核浓缩而具有高SSC值，因 此很容易与低SSC值的碎片的相区别； 凋亡的细胞核的荧光的信道值为10~250， 而碎片的信道值一般为1~5，因此可以将PI 荧光的设定在10信道上，从而去掉碎片。
优点： 快速准确，简单易行，所需样本少，可 做大批量、定量凋亡标本的检测。 缺点：
增殖细胞群
暂不增殖细胞群 G1期细胞类型
(保持着增殖能力但处于休止状态）
永不增殖细胞群
增殖 细胞群
G1D G０
永不增殖细胞群 暂不增殖细胞群
死亡
(二) S期: 合成DNA
(三) G2期:
为M期的细胞分裂作好物质和能量贮备
(四)M期
把复制好的染色体平均地分到两个子细
胞中去
二. 细胞增殖与肿瘤
肿瘤的群体类型
不能区别坏死细胞和凋亡细胞
注意事项：1、单细胞悬液（100万）
2、固定时防止细胞成团
3、低温避光孵育
双参数分析 双参数分析：应用两种荧光染料标记细 胞的成分。
例：Annexin V - PI 的双染色法。 Annexin Ⅴ是一种分子量为35-36kD的Ca2+依赖 性磷脂结合蛋白，能与细胞凋亡过程中翻转到膜 外的磷脂酰丝氨酸（Phosphatidylserine，PS） 高亲和力特异性结合。以标记了FITC的 AnnexinⅤ作为荧光探针，利用流式细胞仪可检测 细胞凋亡的发生。将Annexin Ⅴ与PI匹配使用， 可以将凋亡早期的细胞和晚期的细胞以及死细胞 区分开来。
细胞周期和细胞 凋亡技术
第一节 细胞增殖周期
一、细胞周期概述 细胞周期: 细胞从一次分裂结束开始到 下一次分裂结束为止所经历的过程
G2 M S G 1
G1期（DNA合成前期） 间期 S 期（DNA合成期） G２期（DNA合成后期） 细胞周期 前期 有丝分裂期（M期） 中期 后期 末期
M G2 S G1
又称为程序性死亡
（programmed cell death, PCD）
一.细胞凋亡的特征
形态学特征： 细胞膜向外突起，细胞体积缩小 ↓ 染色质凝缩，然后断裂成碎片 ↓
形成数个大小不等的由膜包裹的凋亡小体
↓ 凋亡小体被邻近细胞吞噬
（2）细胞坏死（necrosis）
概念：细胞受到激烈的物理、化学刺激或 严重的病理性刺激后，引起的细胞损伤和 死亡。 特征：胞膜通透性增高，使细胞肿胀，细 胞器变形或肿大，细胞核破碎，最后细胞 溶解破裂，溶酶体泄漏，引起炎症反应。
1、免疫组织化学方法
适用于冰冻或石蜡包埋的标本
2、流式细胞术
可检测细胞悬液或培养细胞中荧光标记的凋亡
相关的基因产物
3、RT-PCR法检测凋亡调控基因的mRNA表达
4、基因芯片
思考题
1、简述细胞凋亡的分子机制（可以选择三 种通路其中一种） 2、简述检测细胞凋亡最新的几种方法。
前向散射光
凋亡细胞表面有 众多凋亡小体
3、流 式 细 胞 分 析 仪
（Flow Cytometry，FCM）
概念：
流式细胞仪是将流体喷射技术、激光技 术、空气计数、γ-射线能谱术及电子计算机 等技术与显微荧光光度计结合的一种大型的 精密仪器，它通过测量在一定波长的激光激 发快速流动的粒子（细胞或微粒）荧光和散 射激光来获得粒子的一些成分及其变化情况， 进行多参数的、快速的定量分析和分选的技 术。 FCM应用标志着细胞学、肿瘤学、免疫 学等进入了细胞和分子水平的研究。
Tc=TG1+TS+TG2+TM
细 胞 周 期 室
S0
G20 G2
ST
M
S
G1A态: 染色质螺旋化程度较高，RNA含量较少
G1B态: 染色质螺旋化程度较低，RNA含量较多
:
G1
G1B
G1D (分化态)
G1T
ST
G0 (静止态)
二、细胞周期各时相的特点
(一) G1期
限制点( R点) :在G1期存在一个调节细胞周期的开