植物组培快繁研究

（二）培养基的配制
1量取所配培养基总体积的2/3体积的蒸馏水，如要配l升培养基,先量取约700ml体积的水。
表2根据培养基配方，用量筒量取所需要的各种元素的母液。
物质
加入体积或重量
大量元素母液(20×)
50ml
微量元素母液(1000×)
1 ml
铁盐母液(100×)
10 ml
有机物质母液(50×)
20 ml
外植体选取
外植体表面灭菌
愈伤组织的诱导
愈伤组织的增殖
图1 技术路线
2试验方案
植物的最佳繁育方法，首先是由其遗传特异性决定的，单就组织培养而言，它还受植物基因型、外植体种类、部位及培养基种类、激素类型及浓度、培养条件等诸多因素的影响。本试验在参考已有资料的基础上采用正交设计和随机区组试验设计，注重启动培养基配方的研究，各阶段设计方案如下：
mg/L
6-BA
mg/L
NAA
mg/L
蔗糖
g/L
1
0.5
0.1
1.0
15
2
1.0
0.5
2.0
30
3
2.0
1.0
3.0
45
表4叶片愈伤诱导正交设计表
处理
2,4-D
6-BA
NAA
蔗糖
1
0.5
0.1
1
15
2
0.5
0.5
2
30
3
0.5
1
3
45
4
1
0.1
2
45
5
1
0.5
3
15
6
1
1
1
30
7
2Leabharlann Baidu
0.1
3
30
8
2
0.5
5
6
7
8
6-BA
1
1.5
2
2.5
1
1.5
2
2.5
NAA
0.05
0.05
0.05
0.05
0.1
0.1
0.1
0.1
2.2茎段愈伤组织的诱导
本试验以MS培养基为基本培养基，MS培养基配方见表1。表2.3表2.4。采用随机区组试验设计探索生长调节因子6-BA,NAA对树型金银花茎段诱导愈伤组织的适用量，6-BA,NAA8个处理的随机区组试验设计（表2）。
6培养基的保存消毒过的培养基通常放在接种室或培养室中保存，一般应在消毒后的两周内用完，最好不要超过一个月。
五、作业
1．按上述方法配制MS培养基，先配母液，再配培养基，备用。
2．制备母液时应注意哪些问题？为什么？
实验三 树型金银花愈伤组织的诱导和增殖的研究实验
一、实验设计
1研究的技术路线
在查阅有关文献资料的基础上，结合预备试验，主要采用芽、幼嫩茎段和幼嫩叶片，着重从诱导愈伤方面研究树型金银花愈伤最佳诱导体系，主要采用单因素、双因素、以及多因素正交设计的方法，同时用多元分析法进行分析，从而摸索出最佳诱导愈伤条件。筛选出最优体系，具体技术路线如下图：
。
2.3叶片愈伤组织的诱导
(1) 正交实验设计
本试验也是以MS培养基为基本培养基，采用正交设计探索生长因子6-BA、2，4-D、NAA以及蔗糖浓度对树型金银花幼嫩叶片愈伤组织诱导的适用量，每个因子设三种水平（表3），构成四因素三水平的试验设计（表4）。
表3叶片愈伤诱导正交设计因素水平表
水平
因素
2,4-D
3植物生长调节物质母液的配制
植物生长调节物质是培养基的重要组分之一，一般是植物激素类物质，如生长素类的IAA、IBA、NAA，赤霉素类的GA3，细胞分裂素类的2，4-D、KT和6-BA等.由于大多数生长调节物质难溶于水，因此配制方法也各不相同：①IAA，IBA和GA3先用少量95%酒精溶解，再加水定容，摇匀后贮于试剂瓶中、贴上标签后，存放在冰箱中；②NAA可用热水或少量95%酒精溶解，再加水定容至所需容积；③2，4-D可溶于少许1mol·L-1的NaOH溶液中，然后加水定容；④KT和6-BA可用少量1mol·L-1的HCl溶解，再加水定容；⑤玉米素先溶于少量95%酒精中，然后加水定容.
四、方法和步骤：
首先在老师带领下参观组培室，并听取讲解，然后配制洗液，称取工业用重铬酸钾40克，溶解在500ml在水中，然后徐徐加入450ml粗制浓硫酸（或废硫酸）配好的溶液呈红色，铬酸洗液是一种强氧化剂，去污能力强，但玻璃器皿上沾有油脂、凡士林、石蜡等则用此液无效，铬酸洗液可反复使用，直到溶液呈青褐色为止。此溶液腐蚀性强，洗涤时需注意。
三、说明：
在进行各类具体的组培实验前，首先了解组培室的结构及主要设备的用途和性能是十分必要的，总体上的了解有利于以后各实验的进行以及正确的使用各种仪器和设备。
植物组织培养是一项十分细致的工作，为了保证植物外植体不受污染，第一关就是要对各种器皿进行清洗和消毒，使它们保持无菌状态，做这些工作同样有一套科学的方法和需要熟练的技巧，因此每个学生必须学好这套基本功。
2铁盐母液的配制
铁盐的成份含硫酸亚铁（FeSO4·7H2O）和乙二胺四乙酸二钠（Na2-EDTA）.这两种化合物的溶解和混合较为严格，必须按如下方法配制，否则将会产生沉淀.该方法是：分别溶解FeSO4·7H2O和Na2-EDTA，加热并不断搅拌，使之完全溶解，冷却，将2种溶液混合，调PH至5.5，用蒸溜水加至所需容积，棕色瓶保存于冰箱之中.
蔗糖
30 g
琼脂
8 g
吸取母液时，注意应先将几种母液按顺序排好，不要弄错以免使培养基中药品成分发生改变。在培养不同的外植体时，应加入不同的激素。加入一种母液后应先搅拌均匀，避免因不均而使局部浓度过高而引起沉淀，琼脂可于加入蔗糖调节完pH值后再加入，此时应注意搅拌，以免琼脂或蔗糖沉淀于烧杯底而炭化。加热至沸腾片断，以使琼脂充分溶解，检查时可注意烧杯内溶液是否透明。
1
45
9
2
1
2
15
(2)单因素诱导叶片愈伤
本试验也是以MS培养基为基本培养基，采用随机区组试验设计探索生长因子2，4-D不同浓度对树型金银花幼嫩叶片愈伤组织诱导的影响，该因子设四种水平（表5），构成单因素四水平的试验设计。
对器皿和用具进行高压灭菌，即用手提式高压灭菌锅，在1.2个大气压下保持15~20分钟。解剖刀、手术剪、解剖针、镊子等用具在接种前还要用百分之七十的酒精棉球擦一下，再用酒精灯的火焰灭菌，冷却后即可应用。
五、作业：试阐述为什么要对器皿和用具进行严格的洗涤和灭菌？
实验二母液的制备及培养基的配制、灭菌
一、目的要求：
FeSO4·7H2O
母液Ⅳ有机物质
甘氨酸
盐酸硫胺素（Vit.B1）
盐酸吡哆醇（Vit.B6）
烟酸（Vit.B3）
肌醇
1900
1650
370
170
440
22.3
8.6
6.2
0.83
0.25
0.025
0.025
37.3
27.8
2.0
0.1
0.5
0.5
100
20
20
20
20
20
1000
1000
1000
1000
植物生长调节物质浓度通常用ppm（mg·ml-1）和mol·L-1表示，在配制母液时，常以ppm较为方便，一般配制成1 mg·ml-1（ppm）的母液，这个浓度既便于计算，也可避免冷藏时形成结晶.
4有机附加物母液的配制
在植物组织培养时，培养基中往往要加入一些有机附加物，如椰子汁，以促进组织培养活性.由于椰子汁的活性成分是耐热的，在配制时，要先把由果实中采集到的汁液加热煮沸以除去其中的蛋白质，过滤，然后置塑料瓶中贮存于的-200c的低温冰箱内.
扩大倍数
称取量/ mg
母液定溶
体积/ml
配1LMS培养基吸取量/ml
母液Ⅰ大量元素
KNO3
NH4NO3
MgSO4·7H2O
KH2PO4
CaCl2·2H2O
母液Ⅱ微量元素
MnSO4·4H2O
ZnSO4·7H2O
H3BO3
KI
Na2MoO4·2H2O
CuSO4·5H2O
CoCl2·6H2O
母液Ⅲ铁盐
Na2-EDTA
按规定用量,称取所需的各种药品，在配制时为减少工作量，可以把几种药品（如大量元素或微量元素）配在同一母液中（见表1）.但由于各种药品的混合，可能发生反应，生成沉淀物，以致母液失效.为避免类似现象发生，在大量元素、微量元素和维生素及氨基酸的母液配制时，可采用如下2种做法加以解决：①将要配在同一母液的大量元素、微量元素和维生素及氨基酸等化合物，按“表1”所列药品的先后顺序溶解药品，待前一种药品完全溶解后再加入后一种化学药品，以此类推；②使每种成份分别完全溶解，再把它们彼此混合.
1000
1000
1000
100
100
50
50
50
50
50
38000
33000
7400
3400
8800
22300
8600
6200
830
250
25
25
3730
2780
100
5
25
25
5000
1000
1000
1000
1000
50
50
50
50
50
1
1
1
1
1
1
1
10
10
10
10
10
10
1大量元素和微量元素母液的配制
三、说明：
植物材料培养要获得成功，并正常生长，培养基的组成成分是一个决定性因素，不同植物要求不同的培养基，因此，在进行大量工作之前，对不同培养基应进行分析、比较、试验，选择或发展出一个符合试验材料需要的适宜培养基。
大多数植物组织培养所用的培养基由无机营养物、碳源、维生素、生长调节物质和有机附加物等。
配制母液时要用双重蒸馏水等纯度较高的水，药品应采用化学纯或分析纯级，药品的称量及定容都要准确，各种药品先以少量蒸馏水使其充分溶解，然后按培养基上的排列顺序混合。
现以Murashige和Skoog(1962)培养基为例叙述如下：根据各种药品的特点，母液可配成4种。
表1 MS培养基母液的配制
成分
规定用量/mg.L-1
每人清洗部分玻璃器皿，方法：清水洗净→泡入洗衣粉水溶液中进行洗刷→清水反复冲洗→蒸馏水淋一遍→烘干备用。
然后清洗部分较脏的玻璃器皿，方法：采用先碱后酸，即用洗衣粉洗刷后冲洗干净→晾干→侵入酪酸洗液，浸泡时间视器皿的肮脏程度而定→清水反复冲洗干净→蒸馏水淋洗一遍→烘干备用。
带有石蜡或胶布的器皿：先将其除去，再用常规洗涤，石蜡用水煮沸数次即可去掉，胶布粘着物则需用洗衣粉液煮沸数小时，再用水冲洗，凉干后浸入洗液，以后的步骤同前。
5培养基的灭菌一般用手提式医用高压锅来灭菌。
培养基灭菌一般采用湿热灭菌法，即将分装好的培养基放在高压灭菌锅中，加热，待压力上升到0.5kg/cm2时，打开放气阀排净冷空气，关闭放气阀继续加热使压力稳定在1.1~1.2kg/cm2，温度为121摄氏度的条件下，维持15~20分钟，培养基灭菌时间不宜过长，以防引起培养基成分的变化，灭菌后的培养基置于室温下贮存（最适宜的温度为10摄氏度），一般培养基在灭菌后二星期内应用。
四、方法和步骤：
（一）母液的制备
母液的配制是按所使用药品的类别，而分别配成大量元素、微量元素、维生素和铁盐等。配制母液时特别要注意无机盐成分在一起，可能产生的化学反应，如Ca2+和SO2-4,Ca2+,Mg2+和PO3-4一起溶解后，会产生硫酸钙或磷酸钙的不溶物沉淀，因此不能配在一起作母液贮存，应分别配制和保存。
2.1芽愈伤组织的诱导
本试验以MS培养基为基本培养基，MS培养基配方见表2、表3和表4。采用随机区组试验设计探索生长调节因子6-BA,NAA对树型金银花顶芽或侧芽诱导愈伤组织的适用量，6-BA,NAA8个处理的随机区组试验设计（表2）。
表2 芽愈伤诱导激素组合配比表(单位：mg/L)
因素
水平
1
2
3
4
通过掌握培养基对母液制备及常用培养基的配制和灭菌方法，为植物组织培养准备合适的营养条件。
二、材料用具：
高压灭菌锅、冰箱、普通及精密天平、电炉、铝锅、玻璃器皿（烧杯、量微、容量瓶、移液管、试剂瓶、三角瓶、漏斗），化学试剂(CaCl2·2H2O，KNO3，MgSO4·7H2O，
NH4NO3，KH2PO4，Na2—EDTA，FeSO4·7H2O，MgSO4·4H2O，Zn SO4·7H2O，H3BO3，KI，NaMoO4·2H2O，CuSO4·5H2O，CoCl2·6H2O，甘氨酸，盐酸硫胺素，盐酸吡哆醇，烟酸，肌醇，蔗糖，琼脂，若干种生长调节物质及天然复合物，HCL,NaOH,酒精)，以及称量纸、药匙、玻璃棒、精密度纸，瓶盖用纸，线绳或橡皮筋、铅笔、标签纸。
3调节培养基的pH值，用pH计或pH试纸测定
培养基的pH按照培养材料的要求分别用1 mol/L NaOH溶液、1 mol/LHCl溶液来调节所配制培养基的pH值，一般培养基的pH值约为5.8，培养的材料不同，对培养基的pH值要求也不同。
4分装将配制好的培养基分别装在事先洗净的三角瓶，用锡铂纸封口，注明标签，然后和用牛皮纸或报纸包好的培养皿及用三角瓶装好的蒸馏水一道进行高压灭菌。
（一）树型金银花组培快繁技术的研究
实验一组培室设备参观及器皿的洗涤和灭菌
一、目的要求：
1．通过参观，了解组织培养室的几个主要组成部分和各部分应有的基本设备以及有关仪器的用途与功能。
2．通过实际操作，学会洗涤剂的配制和各种器皿的清洗和灭菌方法。
二、材料用具：
高压灭菌锅、烘箱、超净工作台、双筒解剖镜、酸度测定仪、空调机、控温仪、百分之一与万分之一天平、电炉、玻璃器皿（试管、三角瓶、移液管、漏斗、烧杯、容量瓶、试剂瓶、量筒酒精灯），以及镊子、解剖刀、解剖针、手术剪，肥皂、洗衣粉、重铬酸钾、浓硫酸等。