第七章 微生物的生长

一定体积的液体培养基中来研究微生物的生长规律。
一、细菌的同步生长 二、世代时间（代时） 三、生长曲线及其意义 四、连续培养
一、细菌的同步生长
细菌细胞虽小，但与其他生物细胞或个体一样，也
有从小到大的生长过程。目前研究单个细菌生长的技术有
两种： （1）利用电子显微镜观察细胞的超薄切片 （2）使用同步培养（Synchronous culture）技术
1、连续培养器的类型
从控制方式和使用目的两个方面，介绍恒浊器和恒化
器。
（1）恒浊器（Turbidostat） 恒浊器是根据培养器内微生物的生长密度，借光电控
制系统来控制培养液流速，以取得菌体密度高、生长速度
恒定的微生物细胞的连续培养器。
在这一系统中，当培养基的流速低于微生物生长速
度时，菌体密度增高，这时通过光电控制系统的调节，可
恒化器是一种设法使培养液流速保持不变，并使微生
物始终在低于其最高生长速率条件下进行生长繁殖的一种
连续培养装置。这是一种通过控制某一种营养物的浓度，
使其始终成为生长限制因子的条件下达到的，因而可称为 外控制式的连续培养装置。
在恒化器中，一方面菌体密度会随时间的增长而增
高，另一方面，限制生长因子的浓度又会随时间的增长而
三、生长曲线
将少量的细菌纯培养物接种到恒定体积的液体培养基
后，定时取样测定培养基中的细胞数量，可以发现细菌的
群体生长具有一定的规律。若以时间作横坐标，以活菌数 的对数值作纵坐标，可以绘制出一条类似于S型的曲线， 称为细菌的生长曲线。
lgN
迟滞期 对数期 稳定期 衰亡期
0
t
1、滞留适应期（生长停滞期，Lag phase） 当细菌接种到新鲜的培养基后，细菌往往不会立即
生长速率达到最大值，细胞呈几何级数（2n）增加，代时
稳定，生长曲线表现为一条上升的直线。
生长速率常数K最大
特 点
代谢活性强、繁殖速度最快
在形态、大小、生理特性和 化学组成上基本处于一致
影响对数生长期的因素有：菌种、营养成分、营养 物浓度和培养温度等。 一般可在这一时期测定不同细菌的代时，也可用作
研究生理生化和遗传变异的材料或作为生产和科研的菌种。
所谓同步培养技术是设法使群体中的所有细胞尽可 能处于相同的生长状态或细胞周期，然后对群体的各种生
理生化特征加以分析，进而了解单个细胞所发生的变化。
通过同步培养使细胞群体处于相同的分裂状态，即为同步 生长（Synchronous growth）。
获得细菌同步生长的方法主要有两类： （1）通过环境条件来诱导同步性 例如用变换温度、光线或对处于稳定期的培养物添 加新鲜培养基等；
算菌悬液中的活菌数。
N=每套平板的平均菌落数×稀释倍数÷取样体积数 优点：测定的是活菌数。 缺点：操作烦琐，时间长，
（2）液体稀释培养计数法
该法适用于测定在一个混杂的微生物群中虽不占优 势，但具有特殊生理功能的微生物类群。如水和食品中肠
道细菌数量的测定。液体稀释培养计数法的缺点是只能进
行特殊生理群的测定，结果比较粗糙。
（2）比浊法 是一种快速测定菌悬液中微生物细胞数量的方法。当
光线通过菌悬液时，由于菌体细胞不能透光，会造成透光
率下降。在一定的浓度范围内，微生物细胞浓度与菌悬液 的光密度值成正比，与透光度成反比。因此，可使用分光 光度计来进行测定。
由于细胞浓度只在一定范围内与光密度成直线关系，
待测菌悬液的细胞浓度不能过低或过高，同时，菌悬液的
室温
体温
10—20
10—20
20—35
35—40
40—45
4Βιβλιοθήκη Baidu—45
专性
25—45
50—60
70—95
2、温度对微生物的作用 （1）最低生长温度对微生物的影响 最低生长温度是微生物生长的温度下限，低于此温
度，微生物的生长就会受到抑制，但一般不会死亡。因此，
可以利用低温来保藏微生物或者保藏食物，常用的保藏温
（2）通过物理学方法选择出同步的群体 一般可用选择性过滤或梯度离心法来达到。 在这两种方法中，由于诱导法可能造成与正常细胞循 环周期不同的周期变化，所以不及选择法好，在生理学研 究中尤为明显。
二、世代时间（代时）
大多数细菌通过二分裂的方式进行繁殖，即由一个细 胞经过分裂形成两个大小几乎相似的子细胞，每个子细胞 再经过分裂，又各自产生两个子细胞，如此，每分裂一次
第七章 微生物的生长
学时：5 教学内容
1、了解生长的定义和生长的测定方法 2、掌握细菌的群体生长曲线 3、了解环境条件对微生物生长的影响
微生物的生长是指微生物个体或群体细胞各组成成
分按比例、有规律地不可逆增加的过程。微生物的生长从
外部表现为个体数量的增加和群体生物量的增长。
单细胞微生物也有个体生长和细胞分裂繁殖这两个 过程。丝状微生物（霉菌、放线菌）的生长表现为菌丝体 的分枝和延长；繁殖则产生孢子。在实际工作中，单个微
生物细胞太小，研究单个微生物细胞的生长比较困难，并
且也无意义。
所以，微生物的生长通常是指微生物的群体生长！！
个体生长 群体生长 个体繁殖 群体生长
=
个体生长
+
个体繁殖
第一节 生长的测定方法
一、细胞数量的测定 二、细胞生物量的测定
在实际工作中，测定微生物细胞生长的方法可以分为
两类。
镜检直接计数法
促使培养液流速加快，反之亦然，以此来达到恒密度的目 的。因此，培养器的工作精度是由光电控制系统的灵敏度 来决定的。 在恒浊器中的微生物，始终以最高生长速率进行生 长，并可在允许范围内控制菌体的密度。在生产上，为了 乙醇时，都可利用恒浊器。
获得大量菌体或与菌体生长相平行的某些代谢产物如乳酸、
（2）恒化器（chemostat或bsetogen）
第三节 环境条件对微生物生长的影响
微生物生长是微生物自身的遗传特性和外界环境因 素共同作用的结果。在一定限度内，环境因子的变化，可
导致微生物的形态、生理或遗传特性的变化，但如果环境
当然，微生物也可在一定程度上通过自身的代谢活动来改 变环境条件，使之更适应其生存和发展。
因子的改变超过了一定限度，则会造成微生物细胞的死亡。
3、最高生长期（稳定期，Stationary phase） 在对数期以后，由于营养物质逐渐消耗，有害代谢产
物积累，pH值变化等，使细胞生活力下降，细胞的繁殖
速率开始下降，而死亡率上升，当二者趋于平衡时，群体
的活菌数达到最高并保持一段时间的相对稳定。
细胞较小 特 点 胞内积累贮藏物 产生大量的次生代谢产物 芽孢杆菌在此时期开始形成芽孢 通常在这一时期收获菌体细胞或代谢产物。稳定期 的长短也与菌种特性和环境条件有关，在工业生产上为获
1、微生物的生长温度范围 根据微生物对温度的要求和适应能力，可将其分为 低温、中温和高温微生物三种类型：
微生物 类型
低温 微生物 中温 微生物 高温 微生物 专性 兼性 最低(℃) 最适(℃) 最高(℃) -12 -5—0 5—15 10—20 15—20 25—30 生活环境
生活于两极地区 海水及冷藏食品 大多数腐生菌 寄生菌 生活于堆肥、温泉、土壤 表层等高温环境中
细胞总 数测定 细胞数量 的测定 活菌数 测定
比浊法 染色涂片计数法 稀释平板菌落计数法 液体稀释培养计数法 浓缩法
生长的 测定方法
细胞生物 量的测定
细胞干重法 总氮量测定法
DNA含量测定法
代谢活性法
一、细胞数量的测定
1、细胞总数测定
（1）镜检直接计数法 镜检计数法适用于单细胞微生物数量的测定。测定 时需借助计数板和显微镜。细胞较小的细菌可采用比得罗 夫—霍瑟细菌计数板，细胞较大的酵母菌、真菌孢子和血
降低，两者互相作用的结果，使微生物的生长速率正好与 恒速流入的新鲜培养基流速相平衡。这样，既可获得一定 生长速率的均一菌体，又可获得虽低于最高菌体产量，却 能保持稳定菌体密度的菌体。
2、恒浊器和恒化器的比较
3、连续培养的优缺点 高效 优 点 便于自动控制 产品质量较稳定 节约
缺 点
菌种易于退化
营养物的利用率低于分批培养
繁殖，需要经过一定时间来调节自身的生理机能，以适应
新环境。因此，在曲线开始的一段时间，细胞数量几乎不 增加，生长速率趋近于零，曲线平缓。停滞期的后期，由 于细胞逐渐适应了新环境，细胞开始进入活跃生长期，少 数细胞开始分裂，曲线开始上升。
生长速率常数等于零
细胞变长、体积增大
特 点
胞内贮藏物消耗，RNA含量增加
颜色不能太深，不能有其它的颗粒状杂质。比浊法常用于
监测培养过程中的微生物细胞数量的消长情况。其优缺点
与直接计数法相同。
（3）染色涂片计数法
2、活菌数测定 （1）稀释平板菌落计数法 在科研和生产上，为了解微生物活菌数的变化情况，
通常采用平板菌落计数法，这是目前广泛应用的活菌计数
方法。
该方法主要是依据在适当的稀释度下，每一个微生物 细胞可以繁殖成一个菌落，通过测定菌落的数量即可来推
（3）浓缩法
二、细胞生物量的测定
1、细胞干重法 适用于含菌量高或丝状体的微生物，如丝状真菌。 （单细胞细菌，一般1mg干重相当于4—5mg湿菌鲜重，
或相当于4—5×109个细胞。）
2、总氮量测定法 3、DNA含量测定法
4、代谢活性法
第二节 细菌的生长规律
在适宜的条件下，如果提供充足的养料，并及时排出 代谢废物，细菌能够以较高速度繁殖，如漂浮假单胞杆菌 27℃，9.8min即可繁殖一代。通常可将少量微生物接种到
即为一个世代。每经过一个世代，群体数量就增加一倍。
细菌分裂一次所需的时间称为代时，用G表示。
由于细菌的生长是按指数速率进行的，这种类型的群
体生长也称为指数生长，可以用以下的方程式计算： N2=N1*2n
（N1、N2为t1、t2时刻的细胞数，n为分裂的代数） n=3.3(lgN2-lgN1) 假设K为生长速率，则: K=n/(t2-t1)=3.3(lgN2-lgN1)/(t2-t1) 因: G=1/K 故: G=(t2-t1)/3.3(lgN2-lgN1)
影响微生物生长的环境因素较多，概括起来有三大类， 包括物理、化学和生物因素。
温度
物理因素
水分和渗透压 辐射线 超声波
环境因素
化学因素
pH值 氧气和Eh
化学药剂
生物因素
一、温度
温度是微生物生长的重要环境条件之一，不同微生
物的生长繁殖都需要一定的温度范围，表现为最低、最适
和最高生长温度（即温度三基点）。
养方法。 恒定状态可以有效地延长分批培养中的对数期。在恒 定的状态下，微生物所处的环境条件，如营养物浓度、产 物浓度、pH值以及微生物细胞的浓度、比生长速率等可
以始终维持不变，并可以根据需要来调节生长速度。
特点： 1、与密封系统的分批发酵相反，连续培养是在开放系统 中进行的。 2、微生物细胞的生长速度、代谢活性处于恒定状态，可 达到稳定高速培养微生物或产生大量代谢产物的目的。
原生质均匀，呈嗜碱性
代谢活跃，产生各种诱导酶
对不良环境条件敏感
停滞期从几分钟至几小时不等，长短取决于菌种、菌 龄和培养条件。在工业生产上应尽量缩短停滞期以提高生
产效益。常采用对数期的培养物接种到相同的培养环境中，
或适当加大接种量（3-5%）可以缩短停滞期。
2、对数生长期（指数期，Log phase） 细菌在完全适应新环境后，细胞开始转入旺盛生长，
得更多的菌体和代谢产物，可以通过补料、调节pH值、
温度或增大通气量等措施来延长稳定期。
4、衰亡期（Death phase） 细菌经过稳定期，培养基中的营养物逐渐耗尽，有毒 代谢产物大量积累，环境条件进一步恶化，使细胞死亡率 迅速增加，活菌数急剧减少，表现为曲线下降。 细胞大小和形态不一、呈多形 态，有时形成畸形细胞 特 点 革兰氏染色不稳定，G+细菌的 衰老细胞可表现为G－ 芽孢杆菌开始释放芽孢 有的微生物开始产生抗生素
5、生长曲线的意义 生长曲线反映了在有限的培养基中细菌的群体生长
规律，正确认识和掌握细菌的群体生长的特点和规律，对
于科学研究和微生物工业发酵具有重要的指导意义。
四、连续培养
连续培养是指以一定的速度向发酵罐添加新鲜培养 基，同时以相同的速度流出培养液，从而使发酵罐内的培
养液体积维持恒定，使培养物在近似恒定状态下生长的培
细胞则采用血球计数板。
对于细菌 N=每小格的细胞平均数×20000×1000×稀释倍数 对于酵母菌、真菌孢子和血细胞 N=每小格的细胞平均数×4000×1000×稀释倍数
利用直接计数法测定微生物细胞数量时，菌悬液浓度 不宜太低或太高（常大于106个/ml）。 优点：操作简便、快捷；
缺点：难于区分死活细胞和杂质。