%94 小鼠脾脏、胸腺单个核细胞分离

取脾脏
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实验步骤： 实验步骤：
制备单个核细胞悬液： （二）制备单个核细胞悬液： 将取出的脾脏置于盛有PBS缓冲液的平皿 盛有PBS缓冲液的平皿中 然后再置于尼龙指 1. 将取出的脾脏置于盛有PBS缓冲液的平皿中，然后再置于尼龙指 针芯轻轻碾磨使单个核细胞通过尼龙指套悬浮于平皿中 使单个核细胞通过尼龙指套悬浮于平皿中； 套中。用针芯轻轻碾磨使单个核细胞通过尼龙指套悬浮于平皿中； 离心10min 吸取平皿中细胞悬液置于刻度离心管中， 1500rpm离心10min。 2. 吸取平皿中细胞悬液置于刻度离心管中，以1500rpm离心10min。 弃去上清， ACK至2~3ml，轻轻吹打混匀并放置3~4min， 放置3~4min 弃去上清，加ACK至2~3ml，轻轻吹打混匀并放置3~4min，以破坏 红细胞。然后加PBS缓冲液至10ml PBS缓冲液至10ml， 1500rpm离心10min； 离心10min 红细胞。然后加PBS缓冲液至10ml，以1500rpm离心10min； 弃去上清， PBS缓冲液至10ml， 1500rpm离心10min； 缓冲液至10ml 离心10min 3. 弃去上清，加PBS缓冲液至10ml，以1500rpm离心10min； 弃去上清， PBS缓冲液至10ml，吹打混匀即为小鼠脾脏单个核 缓冲液至10ml 4. 弃去上清，加PBS缓冲液至10ml，吹打混匀即为小鼠脾脏单个核 细胞悬液。 细胞悬液。
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密度梯度离心法
血浆
单个核细胞（PBMC） 单个核细胞（ ）
粒细胞 红细胞 离心后
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实验五 小鼠脾脏、 小鼠脾脏、胸腺单个核细胞分离
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解剖图
胸腺位于胸腔胸骨后、纵隔前上方， 胸腺位于胸腔胸骨后、纵隔前上方，覆 胸腔胸骨后 盖在心脏前上方的白色组织。 盖在心脏前上方的白色组织。通常小鼠 鼠龄越小，胸腺体积相对越大。 鼠龄越小，胸腺体积相对越大。
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免疫细胞分离方法： 免疫细胞分离方法：
根据不同免疫细胞表面标志:FACS、 免疫细胞表面标志:FACS 1. 根据不同免疫细胞表面标志:FACS、MACS 2. 根据细胞理化性质： 根据细胞理化性质： 根据细胞比重差异：自然沉降法、密度梯度离心法、 1）根据细胞比重差异：自然沉降法、密度梯度离心法、改变细胞密 度法 根据细胞黏附特性： 2）根据细胞黏附特性：B细胞黏附于尼龙棉 3）根据细胞对渗透压变化的敏感度：红细胞对低渗敏感 根据细胞对渗透压变化的敏感度：
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T细胞表面标志及其亚群
CD3+CD4+CD8-辅助性 细胞 辅助性T细胞 辅助性 （help T cell,Th） ） CD3+CD4-CD8+细胞毒性T细胞 CD3+CD4-CD8+细胞毒性T细胞 细胞毒性 （cytotoxic T cell,Tc or CTL） ） CD4+CD25+调节性 细胞 调节性T细胞 调节性 （regulatory T cell,Tr or Treg） ）
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荧光激活细胞分离仪分离法
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流式细胞分析仪
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MACS
磁性微珠是20世纪80年代初以高分子材料和金属离子（ 磁性微珠是20世纪80年代初以高分子材料和金属离子（如Fe3O4） 世纪80年代初以高分子材料和金属离子 为原料聚合而成的一种以金属离子为核心、 为原料聚合而成的一种以金属离子为核心、外层均匀地包裹高分子聚 合体的固相微粒。 合体的固相微粒。 以磁性微珠为载体， 以磁性微珠为载体，包被上针对某种细胞表面抗原的特异性抗体 即可制成免疫磁性微珠 免疫磁性微珠。 即可制成免疫磁性微珠。
小鼠脾脏、胸腺单个核细胞分离 小鼠脾脏、
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基本概念
所有参与免疫应答以及与免疫应答相关的细胞均被称为免疫细胞。 所有参与免疫应答以及与免疫应答相关的细胞均被称为免疫细胞。 免疫细胞
包括淋巴细胞、单核-巨噬细胞、DC、各种粒细胞、红细胞、 包括淋巴细胞、单核-巨噬细胞、DC、各种粒细胞、红细胞、肥大 淋巴细胞 细胞、干细胞。 细胞、干细胞。
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红细胞计数时，如果每个中方格之间相差超过20个以上， 红细胞计数时，如果每个中方格之间相差超过20个以上，要 20个以上 重新充池计数。正常数值范围内， 重新充池计数。正常数值范围内，两次红细胞计数相差不 得超过5% 5%。 得超过5%。 白细胞计数时， 白细胞计数时，一般情况下各大方格间的细胞数相差不超过 10%。 10%。 如微量吸管内壁沾有白细胞稀释液，会使红细胞破坏， 如微量吸管内壁沾有白细胞稀释液，会使红细胞破坏，故应 先做红细胞计数 稀释液要过滤，试管、计数板均清洁干燥，以免杂质、 稀释液要过滤，试管、计数板均清洁干燥，以免杂质、微粒 等被误认为细胞。 等被误认为细胞。
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小鼠脾脏位于上腹部左后侧， 小鼠脾脏位于上腹部左后侧，体积 脾脏位于上腹部左后侧 较大，长条形态， 较大，长条形态，属于外周免疫器 官。外周血中淋巴细胞可经再循环 驻入脾脏等外周免疫器官的特定区 所以富含各类免疫细胞。 域，所以富含各类免疫细胞。
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实验步骤： 实验步骤：
取小鼠脾脏： （一）取小鼠脾脏： • 小鼠颈椎脱位处死，置70%乙醇溶液 小鼠颈椎脱位处死 颈椎脱位处死， 70%乙醇 乙醇溶液 中浸泡3~5min 3~5min； 中浸泡3~5min； • 取其后右侧卧位，消毒左侧背腹交界 其后右侧卧位，消毒左侧背腹交界 皮肤，取脾脏并尽量将去脂肪及筋 处皮肤，取脾脏并尽量将去脂肪及筋 膜组织。 膜组织。
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NK细胞表面标志 NK细胞表面标志
人类NK细胞表面标志主要以 人类 细胞表面标志主要以 CD16、CD56来认定，临床上将 、 来认定， 来认定 临床上将CD3CD56+CD16+淋巴细胞认定为 细 淋巴细胞认定为NK细 淋巴细胞认定为 胞。
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FACS
流式细胞仪由激光光源系统，气控单细胞层流系统， 流式细胞仪由激光光源系统，气控单细胞层流系统，光检测及信 由激光光源系统 息处理系统和细胞分离纯化系统组成。 息处理系统和细胞分离纯化系统组成。 流式细胞术(FCM)是一种对处在液流中的单个细胞或其它生物微 流式细胞术(FCM)是一种对处在液流中的单个细胞或其它生物微 (FCM)是一种对处在液流中的单个细胞 如细菌）等进行快速定量分析和分选的技术， 粒（如细菌）等进行快速定量分析和分选的技术，它将免疫荧光与细 胞生物学、流体力学、 胞生物学、流体力学、光学和电子计算机等多种学科的高新技术融为 一体，进行细胞和分子水平的基础理论与临床应用研究。 一体，进行细胞和分子水平的基础理论与临床应用研究。 将荧光标记的单克隆抗体加入PBMC悬液内，使二者特异性结合， 将荧光标记的单克隆抗体加入PBMC悬液内，使二者特异性结合， 单克隆抗体加入PBMC悬液内 通过流式细胞仪自动检测，既可很快得到T 通过流式细胞仪自动检测，既可很快得到T、B细胞及其亚群百分率和 绝对值的有关数据，又能以每秒高达5000个细胞(18 5000个细胞(18× 细胞/h) /h)的 绝对值的有关数据，又能以每秒高达5000个细胞(18×106 细胞/h)的 速度分离和收集无菌的淋巴细胞，纯度可达90% 99%， 90%～ 速度分离和收集无菌的淋巴细胞，纯度可达90%～99%，细胞活性亦不 受影响，可用于淋巴细胞的各种免疫生物学功能测定。 受影响，可用于淋巴细胞的各种免疫生物学功能测定。
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B细胞表面标志
SmIg、Fc受体、补体受体、EB病毒受体，部分 SmIg、Fc受体、补体受体、EB病毒受体， 受体 病毒受体 CD分子是B细胞的重要表面标志，其中以SmIg CD分子是B细胞的重要表面标志，其中以SmIg 分子是 细胞所特有，是鉴定B细胞可靠的指标。 为B细胞所特有，是鉴定B细胞可靠的指标。 CD19/CD5分子：可将B细胞区分为B1细胞和B2 CD19/CD5分子：可将B细胞区分为B1细胞和B2 分子 B1细胞和 细胞，B1细胞为CD19和CD5双阳性， B2细胞 细胞，B1细胞为CD19和CD5双阳性，而B2细胞 细胞为CD19 双阳性 仅为CD19阳性，B2细胞为通常所指的B细胞。 仅为CD19阳性，B2细胞为通常所指的B细胞。 CD19阳性 细胞为通常所指的
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计数池
正面观
支持堤
侧面观
1mm 支持堤 支持堤 计数池 缝隙） （0.1mm缝隙） 缝隙
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计数时需要遵循一定的方向逐格进行，以免重复或遗漏，对 压线细胞采用数左不数右，数上不数下 数左不数右， 数左不数右 数上不数下的原则
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细胞数量明显增大时可适当加大稀释倍数。 细胞数量明显增大时可适当加大稀释倍数。 充池时要一次完成，不能产生满溢 满溢、 充池时要一次完成，不能产生满溢、气泡 或充池不足的现象 的现象。 或充池不足的现象。 大小方格内压线细胞的计数遵循数上不数 大小方格内压线细胞的计数遵循数上不数 的原则， 数左不数右的原则 避免多数或漏数。 下、数左不数右的原则，避免多数或漏数。
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实验步骤： 实验步骤：
（三）计算细胞浓度 将上述细胞悬液做一定倍数的稀释 一定倍数的稀释； 1. 将上述细胞悬液做一定倍数的稀释； 加至细胞计数板中，计数细胞计数板中4 混匀稀释后， 2. 混匀稀释后，取1滴加至细胞计数板中，计数细胞计数板中4大方格细胞 总数； 总数； 计算细胞总数： 3. 计算细胞总数： /4） 细胞总数=平均每个大方格中细胞数（ 个大方格细胞总数/4 细胞总数=平均每个大方格中细胞数（4个大方格细胞总数/4）X104X稀 释倍数。 释倍数。
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免疫磁珠法细胞分选过程
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免 疫 磁 珠 细 胞 分 选 装 置
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全自动细胞分选系统
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密度梯度离心法
Ficoll-Hypaque密度梯度离心法： Ficoll-Hypaque密度梯度离心法： 密度梯度离心法 人外周血单个核细胞(peripheral blood 外周血单个核细胞(peripheral mononuclear cell PBMC)包括淋巴细胞和单核细胞，其 PBMC)包括淋巴细胞和单核细胞， 包括淋巴细胞和单核细胞 体积、形状和比重与其他细胞不同 与其他细胞不同， 体积、形状和比重与其他细胞不同，利用密度在 1.077±0.001g/L之间近于等渗的Ficoll-Hypaque混合溶 之间近于等渗 1.077±0.001g/L之间近于等渗的Ficoll-Hypaque混合溶 称为淋巴细胞分层液)作密度梯度离心时, 液(称为淋巴细胞分层液)作密度梯度离心时,各种血液成 分将按密度梯度重新分布聚集。 分将按密度梯度重新分布聚集。
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实验步骤： 实验步骤：
（四）计算细胞活力 • 50μl细胞悬液+ 50μl的0.2%苔盼兰溶液并混匀； 50μl细胞悬液+ 50μl的0.2%苔盼兰溶液并混匀 苔盼兰溶液并混匀； 细胞悬液 • 显微镜下观察，如果细胞被染成蓝色，旋转显微镜微调节钮，细 显微镜下观察，如果细胞被染成蓝色，旋转显微镜微调节钮， 胞无反光， 为死亡；而细胞不被染色，晶莹透亮， 胞无反光，则为死亡；而细胞不被染色，晶莹透亮，旋转显微镜 调节钮，细胞明显反光而且有立体感，为活细胞； 调节钮，细胞明显反光而且有立体感，为活细胞； • 计算细胞活力：计数200个细胞中活细胞的百分率，一般活力应 计算细胞活力：计数200个细胞中活细胞的百分率， 200个细胞中活细胞的百分率 95%以上 以上。 在95%以上。
通常有二种分离方式：阳性分离和阴性分离。 通常有二种分离方式：阳性分离和阴性分离。
基本原理及步骤：首先将抗特异细胞表面抗原的抗体致敏到磁珠 基本原理及步骤：首先将抗特异细胞表面抗原的抗体致敏到磁珠 致敏 待它与混合体系中的细胞反应后，利用磁力的作用， 上，待它与混合体系中的细胞反应后，利用磁力的作用，使与致 敏结合的细胞与其它物质分离 达到纯化、分离的目的。 分离， 敏结合的细胞与其它物质分离，达到纯化、分离的目的。
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不同细胞密度不同
人的红细胞密度为1.093 人的红细胞密度为 粒细胞密度为1.092 粒细胞密度为1.092 单个核细胞（淋巴细胞和单核细胞） 单个核细胞（淋巴细胞和单核细胞）的密度为 1.075-1.090
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不同细胞密度不同
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用1.077±0.001的分层液可将细胞分离 1.077±0.001的分层液可将细胞分离