理论3：聚合酶链式反应(PCR)及引物设计

2、基因的体外突变： 可以随意设计引物在体外对目的基因片段 进行嵌和、缺失、点突变等改造。
2014全国分子细胞生物学实验技术培训班
www.yrbio.com
PCR的应用
3、DNA和RNA的微量分析： PCR技术高度敏感，对模板ＤＮＡ的含量要求很低， 是DNA和ＲNA微量分析的最好方法。实际工作中，一 滴血液、一根毛发或一个细胞已足以满足PCR的检测需 要，因此在基因诊断方面具有极广阔的应用前景。 4、基因转录水平检测 RT-PCR可检测不同组织或细胞中基因的转录水平 5、基因突变分析： 利用PCR与一些技术的结合可以大大提高基因突变检测 的敏感性。
www.yrbio.com
实验步骤
准备PCR反应溶液，取0.2 mL PCR管，按以下顺序加入各试 剂： PCR反应体系 无菌超纯水 38 μL 10×buffer 5.0 μL dNTP mix 2.5 μL 引物Tpm4-F 1 μL 引物Tpm4-R 1 μL 模板（ TS-Tpm4 ） 2 μL Taq酶 0.5 μL 合计 50 μL
PCR反应体系
PCR反应条件优化
PCR的应用
2014全国分子细胞生物学实验技术培训班
www.yrbio.com
PCR的成分和作用
1. 缓冲液： 10 ～ 50 mM Tris- Cl (pH8.4) 25 ～ 50 mM KCl 0.5 ～ 2.5 mM MgCl2 维持 Taq 酶作用环境 促进引物退火 Taq 酶具有 Mg2+依赖性
PCR反应条件优化
⑶ 延伸温度和时间：
延伸温度一般位于Taq酶最适作用温度70 ～ 75 ℃
之间，常用72 ℃
延伸时间，可根据待扩增片段的长度和使用的Taq酶 而定，一般taq酶的扩增效率是1kb/1min
延伸时间过长可出现非特异扩增。
2014全国分子细胞生物学实验技术培训班
www.yrbio.com
2. 引物的GC%含量：一般为40%-60%。上下游引物的 GC含量不能相差太大。
2014全国分子细胞生物学实验技术培训班
www.yrbio.com
引物设计的原则
3. 引物序列在模板内应当没有相似性较高，尤其是3’端 相似性较高的序列，否则容易导致错配。
4. 引物3’端的末位碱基避开密码子的第3位，且最好不选 择A 5. 引物的5′端可以修饰，而3′端不可修饰。
PCR反应体系
PCR反应条件优化
PCR的应用
2014全国分子细胞生物学实验技术培训班
www.yrbio.com
PCR技术原理
聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)， 是一种在体外快速扩增特定基因或DNA序列的方法， 故又称为基因的体外扩增法。
PCR不仅可以用于基因的分离、克隆和核苷酸序列分 析，还可以用于突变体和重组体的构建，基因表达调 控的研究，基因多态性的分析，遗传病和传染病的诊 断，肿瘤机制的探索，法医鉴定等诸多方面。
2014全国分子细胞生物学实验技术培训班
www.yrbio.com
实验原理
PCR技术原理
引物设计的原则 PCR的成分和作用
PCR反应体系
PCR反应条件优化
PCR的应用
2014全国分子细胞生物学实验技术培训班
www.yrbio.com
PCR的应用
1、目的基因的克隆： PCR技术为在重组DNA过程中获得目的基 因片段提供了简便快速的方法。
4.
模板DNA (Template): 最低102 ～ 105 DNA片段，实际用量远远超过此量， 用量需在实验中摸索。1 ～ 5 μl
2014全国分子细胞生物学实验技术培训班
www.yrbio.com
PCR的成分和作用
5. Taq DNA 聚合酶 耐高热 0.5 ～ 5 U / 100 μl
1U / 25 ～ 50μl
PCR扩增特异性取决于复性过程中引物与模板
的结合。 退火温度的选择，可根据引物的长度和G+C含量确 定，一般位于40 ～ 60℃，30 ～ 60 s。 退火温度越高，产物特异性越高。退火温度越低， 产物特异性越低。 设置退火温度梯度，摸索最佳退火温度！
2014全国分子细胞生物学实验技术培训班
www.yrbio.com
2014全国分子细胞生物学实验技术培训班
www.yrbio.com
聚合酶链式反应（PCR）
1 2 3 4 5 实验目的 实验原理（PCR及引物设计）
实验仪器、试剂及耗材 实验步骤
实验结果及讨论
2014全国分子细胞生物学实验技术培训班
www.yrbio.com
实验仪器、试剂及耗材
实验仪器及耗材 PCR仪、移液器、0.2 mL PCR管、各种规格的吸头。
100μg / ml 牛血清白蛋白 (BSA) 对酶有一定的保护性
2. dNTPs :
dATP、 dGTP 、dCTP、dTTP——底物 0.5 ～ 2.5 μM
2014全国分子细胞生物学实验技术培训班
www.yrbio.com
PCR的成分和作用
3. 引物 (Primer-P)： 预扩增核酸片段两端的已知序列，决定特异性。 0.1 ～ 1 μM
引物P1： 引物P2： Taq 酶 (5U/μl)： 水： 1.0μl ×6 = 6.0μl 1.0μl ×6 = 6.0μl 0.2μl × 6 = 1.2μl 22.8μl × 6 = 136.8μl
冰上操作！
共174μl，先用移液器 / 指弹混匀，后用离心机瞬时 混匀（管壁上液体沉至管底）。
2014全国分子细胞生物学实验技术培训班
2014全国分子细胞生物学实验技术培训班
理论三：聚合酶链式反应 (PCR)及引物设计
主讲人：刘彩云 1459728972@qq.com
www.yrbio.com
Contents
聚合酶链式反应（PCR） 的技术原理
及实验操作
PCR引物设计软件的使用（ Primer
Premier 5.0 ）
2014全国分子细胞生物学实验技术培训班
PCR反应条件优化
⑷ 循环数： 其他参数选定后，PCR循环次数主要取决于模板 DNA的浓度。
理论上说20 ～ 25次循环后，PCR产物的积累即
可达到最大值，实际操作中由于每步反应的产率不可能 达到100%，因此不管模板浓度是多少，20 ～ 30次是 比较合理的循环次数。 循环次数越多，非特异扩增增加。
72˚C
2014全国分子细胞生物学实验技术培训班
www.yrbio.com
PCR技术原理
2014全国分子细胞生物学实验技术培训班
www.yrbio.com
PCR出现的问题：
PCR扩增未得到目的条带？
引物是否合 适?
扩增出目的条带之外的多条带（非特异性）？ 扩增的目的条带很弱？
引物设计是PCR 技术中至关重要的一环
www.yrbio.com
聚合酶链式反应（PCR）
1 2 3 4 5 实验目的 实验原理（PCR及引物设计）
实验仪器、试剂及耗材 实验步骤
实验结果及讨论
2014全国分子细胞生物学实验技术培训班
www.yrbio.com
实验目的
了解PCR的基本原理
掌握PCR的基本操作技术
学习引物设计的原则及引物设计软件Primer5的使用
www.yrbio.com
PCR反应体系
2. 另取 5 支0.2ml PCR管，分别加入上述液体29μl。 3. 分别取标本模板各1μl，加入上述5支PCR 管中，混匀，离心机瞬时离 心，备用。 4. 反应条件：PCR扩增仪
94℃5 ′
94℃ 30″ 55℃ 30″ 72℃ 45″
72 ℃ 5′
30个循环
2014全国分子细胞生物学实验技术培训班
www.yrbio.com
引物设计的原则
6. 引物无回文对称结构，否则会形成发夹结构； 引物自身不能配对，否则易形成约两个引物长度的引物二 聚体；
2014全国分子细胞生物学实验技术培训班
www.yrbio.com
实验原理
PCR技术原理
引物设计的原则 PCR的成分和作用
2014全国分子细胞生物学实验技术培训班
www.yrbio.com
PCR技术原理
以拟扩增的DNA分子为模板，以一对分别与模板5′ 末端和3′末端互补的寡核苷酸片段为引物，在DNA聚合 酶的作用下，按照半保留复制的机制沿着模板链延伸直 至完成新的DNA合成，重复这一过程，即可使目的DNA片 段得到扩增。
2014全国分子细胞生物学实验技术培训班
www.yrbio.com
PCR技术原理
变性
退火
延伸
在加热或碱性 条件下可使DNA 双螺旋的氢键 断裂，形成单 链DNA
模板与引物的 复性,引物是与 模板某区序列 互补的一小段 DNA片段。
94˚C
Tm-5˚C
从结合在特定 DNA模板上的 引物为出发点 ，按5’→3’的 方向沿着模板 顺序合成新的 DNA链
（购自YRBIO基因库www.yrgene.com）；
无菌超纯水； 琼脂糖。
www.yrbio.com
2014全国分子细胞生物学实验技术培训班
聚合酶链式反应（PCR）
1 2 3 4 5 实验目的 实验原理（PCR及引物设计）
实验仪器、试剂及耗材 实验步骤
实验结果及讨论
2014全国分子细胞生物学实验技术培训班
加热90～95℃，30 ～ 60 s，再复杂的DNA分子也 可变性为单链。根据模板DNA复杂程度，可以调整变 性温度和时间。一般情况下选择94 ℃ 30 ″，可使各种 复杂的DNA分子完全变性。
2014全国分子细胞生物学实验技术培训班
www.yrbio.com
PCR反应条件优化
⑵ 退火温度和时间：
2014全国分子细胞生物学实验技术培训班
www.yrbio.com
实验原理
PCR技术原理
引物设计的原则 PCR的成分和作用
PCR反应体系
PCR反应条件优化
PCR的应用
2014全国分子细胞生物学实验技术培训班
www.yrbio.com
PCR反应条件优化
⑴ 变性温度和时间： 保证模板DNA解链完全是保证整个PCR扩增成功的 关键。
引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构
引物不能在模板的非目的位点引发DNA 聚合反应(即 错配)。
2014全国分子细胞生物学实验技术培训班
www.yrbio.com
引物设计的原则
一般原则： 1. 引物的长度：配对引物的长度一般在15-30bp之间比 较合适。
尽可能使用两条引物的Tm值相同（最好相差不要超过 5℃） Tm值的计算：一般的公式：Tm = 4 (G+C) + 2(A+T)
2014全国分子细胞生物学实验技术培训班
www.yrbio.com
实验原理
PCR技术原理
引物设计的原则 PCR的成分和作用
PCR反应体系
PCR反应条件优化
PCR的应用
2014全国分子细胞生物学实验技术培训班
www.yrbio.com
引物设计的原则
基本原则： 引物与模板的序列要紧密互补
2014全国分子细胞生物学实验技术培训班
www.yrbio.com
聚合酶链式反应（PCR）
1 2 3 4 5 实验目的 实验原理（PCR及引物设计）
实验仪器、试剂及耗材 实验步骤
实验结果及讨论
2014全国分子细胞生物学实验技术培训班
www.yrbio.com
实验原理
PCR技术原理
引物设计的原则 PCR的成分和作用
2014全国分子细胞生物学实验技术培训班
www.yrbio.com
实验仪器、试剂及耗材
实验试剂


10×PCR buffer (Mg2+ Plus)（YRBIO）；
dNTP mix (2.5 mM each) （YRBIO）； Taq DNA Polymerase (2U / μL) （YRBIO）； 引物：Tpm4-F/Tpm4-R，引物溶液浓度为10 μM； Tpm4基因模板质粒:
常用30μl
各种成分的实际用量应根据实验者选用的该成 分的终浓度及所拥有的储备液浓度进行核算。
2014全国分子细胞生物学实验技术培训班
www.yrbio.com
பைடு நூலகம்
PCR反应体系
操作： 5份标本 总体积 30μl ×6 = 180μl
1. 取一 0.5 ml Ep 管，加入下列试剂： 10×buffer： 3μl ×6 = 18μl dNTPs: 1.0μl×6 = 6.0μl
6. 水： 去离子水，补足整个反应体积。
2014全国分子细胞生物学实验技术培训班
www.yrbio.com
实验原理
PCR技术原理
引物设计的原则 PCR的成分和作用
PCR反应体系
PCR反应条件优化
PCR的应用
2014全国分子细胞生物学实验技术培训班
www.yrbio.com
PCR反应体系