荧光光谱仪原理及其使用方法(哪些峰不是样品峰)

荧光分光光度计示意图
激发单色器
光源
PM
分束器
— —光闸
样品池
发射单色器
PM
主要部件
➢光源：氙灯、高压汞灯、激光； ➢样品池：石英（低荧光材料）； ➢两个单色器：选择激发光单色器；
分离荧光单色器； ➢两个检测器：光电倍增管。
RF-5301PC光路图
仪器性能
高水平灵敏度：蒸馏水的拉曼峰S/N比为150以上 （EX350nm，狭逢5nm ）
➢最普通的是荧光. 如果当 一个物质吸收一定波 长的光然后给出较长波长的光称为荧光. 一些 油漆、纸张具有荧光特性.
➢其次是磷光. 当一种物质吸收光，然后再发出 光称为磷光.如果磷光物质暴露在阳光下，然后 再带到暗室内,给出的光称为磷光.
➢化学发光：当 2 种化学物质混合后给出的光.
➢萤火虫发光是一种生物发光.萤火虫会产生.荧 光素酶，导致发光. 类似化学发光，两种生物 化学物质混合产生光.
样品形态
• 液体
– Cell suspensions – Transparent solutions
• 固体
– Powders – Cells mounted on slides
荧光分析的特点
➢ 灵敏度高：视不同物质，检测下限在0.1 - 0.001g/mL之间。 比UV-Vis的灵敏度高得多！
吸收光谱是由基态最低振动能层
跃迁到第一电子激发单重态的各个振
动能层而形成，即其形状与第一电子
激发单重态的振动能级分布有关。
由于激发态和基态的振动能层分
布具有相似性，因而呈镜像对称。
S1 荧光
S0
产生荧光的条件
i）分子具有Leabharlann Baidu辐射频率相应的荧光结构（内因）；
ii）吸收特征频率的光后，应可产生具一定量子效率的荧光。 即量子效率 足够大：
扩展功能和附件
大样品室可安装 ➢各种样品池架 ➢ＬＣ流动样品池 ➢偏光装置等
丰富的任选附件：
单一恒温样品池（带搅拌器）
该部件在恒温状态下搅拌试样，进 行测定，最适合浮游细胞的荧光测 定。利用恒温水的循环，可使样品 池恒温化。搅拌器的速度可调节
恒温水循环装置
使用温度范围：室温—85 0C 温度调节精确度：+0.05 0C 泵的流量：最大15L/18L/min(50/60Hz) 容器的容量：约6.8L
分子吸收、荧光、磷光辐射跃迁
无辐射跃迁——去活化过程
处于激发态分子不稳定，通过辐射或非辐射跃迁等去活 化过程返回至基态 。这些过程包括： 1）振动弛豫
在液相或压力足够高的气相中，处于激发态的分子因碰 撞将能量以热的形式传递给周围的分子，从而从高振动能层失 活至低振动能层的过程，称为振动弛豫。 2）内转换
• 2次或3次光
– 发生在激发波长的2倍或3倍波长处
瑞利散射
颗粒的大小小于入射光的波长. 光通过样品后频率不变.由于弹性碰撞不存在能量 的转移.光线只是简单地改变方向，波长不变. 粉末、悬浮液等样品.
拉曼散射
样品吸收和发射光并伴随有能量转移的产生. 光通过样品后光的波长、频率发生了改变.
与入射光相比发射光的频率可能更高或者更低.
Ref-41
恒温四连池架
利用恒温水的循环，一次可使4个 样品池恒温化。
适用的温度范围：5 0C--80 0C
微量样品池装置
取400ul的少量试样就能测定。 试样可以放入与四面研磨样 品池大小（10mm)的槽中，
安装在样品池架上进行测定。
Ref-42
测定偏光的辅助装置
（用于紫外可见光或只用于可见光）
If = 2.3f I0 bc=KC
If = 荧光相对强度 f = 量子效率 I0 = 入射光强度 = 吸收系数 b = 光程长 c = 浓度 该式只有bc <<0.05时才成立，即荧光测定只有在极 稀溶液中才可测定，否则校正曲线向浓度轴弯曲。
标准表与标准曲线
荧光分光光度计 原理和结构
激发光谱形状与吸收光谱形状完全相似，经校正后二 者完全相同！这是因为分子吸收光能的过程就是分子的激 发过程。
激发光谱可用于鉴别荧光物质；在定量时，用于选择 最适宜的激发波长。
2）发射光谱 发射光谱即荧光光谱。
一定波长和强度的激发波长 辐照荧光物质，产生不同波 长的强度的荧光，以荧光强 度对其波长作图可得荧光发 射光谱。
对于具有相同多重度的分子，若较高电子能级的低振动能 层与较低电子能级的高振动能层相重叠时，则电子可在重叠的 能层之间通过振动耦合产生无辐射跃迁，如S2-S1；T2-T1。
定性分析
任何荧光都具有两种特征光谱：激发光谱与发射光谱。 它们是荧光定性分析的基础。 1）激发光谱
改变激发波长，测量在最强荧光发射波长处的强度变 化，以激发波长对荧光强度作图可得到激发光谱。
➢ 选择性好：可同时用激发光谱和荧光发射光谱定性。 ➢ 结构信息量多：包括物质激发光谱、发射光谱、光强、荧光
量子效率、荧光寿命等。 ➢ 应用不广泛：主要是因为能发荧光的物质不具普遍性、增强
荧光的方法有限、外界环境对荧光量子效率影响大、干扰测 量的因素较多。
功能强大、操作简便的软件系统
功能： ➢激发光谱、荧光、同时光谱测定 ➢定量分析（１－３次标准曲线） ➢时间扫描—动力学
检索最佳的激发光和荧光波长
➢只需打开
自动检索最佳激发光和荧光波长
➢从瑞利散射、拉曼散射及２次光中自动判断出荧光
➢使复杂的波长设置简单化
多样的数据处理
➢四则运算 ➢数据变换（1-4介导数，倒数，对数） ➢曲线平滑 ➢峰值检测 ➢面积计算 ➢活度值计算等 ➢计算平均值
岛津荧光光谱仪RF-5301PC
岛津国际贸易（上海）有限公司
分子发光
处于基态的分子吸收能量（电、热、化学和光能）被激 发至激发态，然后从不稳定的激发态返回至基态并发射出光 子，此种现象称为发光。发光分析包括荧光、磷光、化学发 光、生物发光等。
物质吸收光能后所产生的光辐射称之为荧光和磷光。
不同类型的发光
激发光谱告诉我们什么？
• 化合物吸收波长 • 吸收强度 • 溶剂吸收波长
激发光谱
发射光谱告诉我们什么？
• 化合物荧光波长 • 荧光强度 • 拉曼和瑞利散射
发射光谱
哪些峰不是样品峰
• 瑞利散射
– 激发波长峰 – 发射和激发相同波长的峰
• 拉曼散射
– 溶剂发射波长(documented) – 与激发波长相差固定频率的波长
发射的光量子数
= ————————
吸收的光量子数
影响荧光及强度的因素
1）跃迁类型：具有—*及n—*跃迁结构的分子才会产生荧光。 且具—*跃迁的量子效率比n—*跃迁的要大得多。
•芳香属分子
2）共轭效应：共轭度越大，荧光越强。
•平面环系统，绝大多数荧光物质含有芳香环或杂环
3）刚性结构：分子刚性（Rigidity）越强，分子振动少，与
减弱到消失
5）溶剂效应： 溶剂极性可增加或降低荧光强度（改变—*及 n—* 跃迁的能量）； 与溶剂作用从而改变荧光物质结构
来增加或降低荧光强度。 6）温度：温度增加，荧光强度下降（因为内、外转换增加、粘度
或“刚性”降低）。因此体系降低温度可增加荧光分析灵敏度。 7）pH值：具酸或碱性基团的有机物质，在不同pH值时，其结构
利用荧光偏光度的测定获得关于分子的 大小、流动性及分子周围环境的信息。
高灵敏度池架
固体（粉末）样品架
固体、粉末样品，甚至样品池 中的溶液也能用反射方式进行 荧光测定。
高台样品架
LC流动样品池（12ul)
用于高速液相色谱分析的高灵敏度分 光荧光监控。自由选择激发光波长和 荧光波长，可进行有选择的检测。
可能发生变化，因而荧光强度将发生改变；对无机荧光物质， 因pH值会影响其稳定性，因而也可使其荧光强度发生改变。 8）荧光猝灭：碰撞猝灭；静态猝灭；转入三重态的猝灭； 电子转移猝灭；自猝灭。
测量过程
• 提供能量 (光源) • 选择激发波长 (吸收) • 照射样品 • 样品吸收与发射荧光 (发射) • 选择发射波长 • 测量
其它分子碰撞失活的机率下降，荧光量子效率提高。
如荧光素（大）与酚酞（=0）；芴（=1）与联苯（ =0.18）。
4）取代基： 给电子取代基增强荧光（p-共轭），如-OH、-OR、 -NH2、-CN、NR2等； 吸电子基降低荧光，如 -COOH、-C=O、 NO2、-NO、-X等；如苯环被卤素取代，从氟苯到碘苯，荧光逐渐
瑞利、拉曼散射和2次光
瑞利散射峰350 ↙
拉曼峰397 ↙
2次光
699 ↙
792 ↓
外来峰的校正
• 截止滤光片去除2次、3次等高次光 • 差谱法去除拉曼和瑞利散射峰 • 用高纯溶剂 (无荧光) • 扫描溶剂确定拉曼峰 • 维持测定温度与条件
高通和带通滤光片套件
高通滤光片用于去除散射光
定量
荧光强度与浓度的关系
荧光应用领域—食品科学
氨基酸、蛋白质、脂质、碳水化合物、维生素、辅酶、抗生物质，食 品添加物（调味料、防酸化剂等），食物油（植物油、动物油），农 药（氨基甲酸酯类、有机磷类、1-萘基醋酸） （1） 食品的成分分析、定量分析 （2） 残留农药的检测
荧光应用领域—化学、环境科学
各种有机化合物、无机化合物、高分子化合物（纤维、塑料、橡胶等） （1） 微量分析 （2） 物性研究 （3） 光化学反应研究 （4） 高分子聚合研究 （5） 光敏材料的研究 （6） 大气、水质、土壤的污染评估多环芳香烃类 （7） 原油、煤的分析
LC流动样品池（120ul)
用于分析邻苯二酚胺。使用内容 积120ul的散射光少的双面反射型 石英微型的流动样品池。
光电倍增管
换用光电倍增管，可进行 900nm以内的荧光光谱的测定。
直径8mm的试管架
可以安装试管
荧光应用领域—生命科学
氨基酸、缩氨酸、蛋白质、脂质、糖类、维生素、辅酶、胺类等 （1） 定性、定量 （2） 研究酶反应：分析研究基质、辅酶、蛋白质（色氨酸、3-对羟 基苯基丙氨酸）的反应机理 （3） 抗原、抗体反应 （4） 研究蛋白质-蛋白质，核酸-蛋白质，糖-蛋白质的相互作用 （5） 利用荧光检验（Fura-2等），分析细胞内离子（Ca2+等） （6） 分析神经传递物质（苯邻二酚胺等） （7） 研究核酸 （8） 研究生物膜
换句话说，不管激发波长如何，电子都是从第一电子激发态的 最低振动能层跃迁到基态的各个振动能层。
iii）镜像对称
通常荧光光谱与吸收光谱呈镜像对称关系。
蒽的荧光光谱和吸收光谱
解释：能层结构相似性
荧光为第一电子激发单重态的最
低振动能层跃迁到基态的各个振动能
层而形成，即其形状与基态振动能级
分布有关。
吸收
狭逢10nm拉曼峰S/N＞600
仪器性能
➢利用先进的直流式长驱动机构，可及为迅速的得到理想的 光谱 ➢可进行高速光谱监控，最高扫描速度５５００ｎｍ／ｍｉｎ ➢波长范围：220-900nm及0次 ➢狭逢：1.5、3、5、10、15、20nm6档及激发6nm半高 ➢波长精度：± 1.5nm ➢波长扫描速度Survey,Super,VeryFast,Medium,Slow,Very Slow 的7段转换；Survey,约5,500nm/min.Super约3,000nm/min.
由于不同物质具不同的 特征发射峰，因而使用荧光 发射光谱可用于鉴别荧光物 质。萘激发、荧光、磷光如 右图所示。
激发光谱与发射光谱的关系
i）波长比较
与激发（或吸收）波长相比，荧光发射波长更长，即产生所谓
Stokes位移。（振动弛豫失活所致） ii）形状比较
荧光光谱形状与激发波长无关。尽管分子受激到可到达不同能 级的激发态，但由于去活化（内转换和振动弛豫）到第一电子激发 态的速率或几率很大，好像是分子受激只到达第一激发态一样。