叶绿体的提取与荧光观察

叶绿体的分离与荧光观察
一）实验目的：
1.通过植物细胞叶绿体的分离，了解细胞器分离的一般原理和方法。

2.观察叶绿体的自发荧光和次生荧光，并熟悉荧光显微镜的使用方法。

二）实验原理：
细胞器分离的过程包括两个主要阶段：破碎细胞和细胞组分的分离。

在等渗溶液中进行组织匀浆、分离，叶绿体的分离采用差速离心或密度梯度离心法进行。

利用荧光显微镜观察叶绿体的自发荧光和间接荧光（次生/诱发荧光）。

离心分离技术是分离细胞组分和生物大分子最常用的分离方法，因为不同的细胞器和分子有不同的体积和密度，可在不同离心力不同介质沉降分离。

吖啶橙是一种与DNA和RNA都能结合的荧光染料，在紫外光或蓝光(330～485nm)激发下，DNA可被激发出530nm的荧光发射峰(细胞核发亮绿色荧光)，RNA可被激发出640nm 的荧光发射峰(核仁和胞质RNA发桔红色荧光)。

产生两种不同荧光是由于吖啶橙与双链DNA 和单链DNA或RNA的结合方式和结合量不同而决定的。

DNA是高度聚合物，它与DNA结合是潜入双链之间，结合量相对少；而与单链DNA或RNA的结合则由静电吸引堆积在磷酸根上，结合量相对多些。

我们推测，叶绿体的次生荧光的来由，大部分来自叶绿体的吸附作用，极少部分来自叶绿体中的RNA.
三）实验用品
材料：菠菜叶片
试剂：蒸馏水，0.35mol/L氯化钠溶液，0.01%吖啶橙(AO)
仪器：普通离心机，组织捣碎机，天平，荧光显微镜，显微镜，镊子，培养皿，纸，移液管，滴管，烧杯，无荧光载片，盖玻片，离心管,吸水纸等
四）实验步骤：
1、叶绿体悬浮液的制备
菠菜叶片(去叶脉)3g → 0.35mol/L氯化钠15ml→研磨→匀浆过滤(6层纱布)→滤液在
1000r/min离心2min→弃沉淀，上清液3000r/min离心5min →去上清液→沉淀为叶绿体(混有部分细胞核)，用0.35mol/L氯化钠溶液悬浮→滴片观察
2、叶绿体的显微与荧光观察
取叶绿体悬液1滴置于载玻片上，加盖玻片后用分别用普通光学显微镜观察叶绿体的形态结构和荧光显微镜观察自发荧光。

将叶绿体悬液滴在无荧光的载玻片上,再滴加1滴0.01%吖啶橙荧光染料，盖上无荧光的盖玻片,使用荧光显微镜观察间接荧光。

五）实验结果与分析：
1、实验结果：
六）注意事项
1、叶绿体的分离应在等渗溶液(0.35mol/L氯化钠)中进行,以免渗透压的改变使叶绿体受到损伤。

2、分离过程最好在0~5℃的条件下进行；如果在室温下，要迅速分离和观察。

3、离心机使用：离心管要平衡
4、凡是荧光染料都有一定毒性，请做好防护
5、在荧光观察时应抓紧时间,有必要时立即拍照。

6、在制作荧光显微标本时最好使用无荧光载片、盖片和无荧光油。

7、汞灯开启后15min内不要关闭，关闭后3min内不要开启。