化学发光常见问题集锦

Beckman Coulter ACCESS®系列全自动微粒子化学发光

免疫分析系统

常见问题及答疑

目录

第一部分：化学发光基础知识 第1--17问 第二部分：仪器应用部分 第18--74问 第三部分：项目应用部分第75—107问

第一部分：化学发光基础知识

1 什么是化学发光，与放免、酶免比较有何不同？

化学发光免疫分析（Chemiluminescence Immunoassay，CLIA）是将化学发光与免疫反应相结合，用于检测微量抗原或抗体的一种新型标记免疫测定技术。

化学发光免疫分析比放射免疫，酶联免疫具有更高灵敏度，具备操作简便、快速的特点，易于标准化操作。且测试中不使用有害的试剂，试剂保存期长，应用于生物学、医学研究和临床实验诊断工作，成为非放射性免疫分析法中最有前途的方法之一。

（1）与放免（RIA）产品比较

与放射免疫试剂（RIA）比较，化学发光避免了放射性核素的污染以及对操作人员的伤害，大大缩短了反应时间，同时兼具高灵敏度的优势。

（2）与酶免（ELISA）产品比较

灵敏度与可测范围远远高于酶免产品，兼具ELISA法简便的操作方法与较短的反应时间。

2 什么是标记免疫技术，它的三大要素是什么？

将Ag或Ab用标记物(如荧光素、酶、放射性同位素、化学发光物质等)进行标记，在与标本中的相应Ab或Ag反应后，可以不必测定Ag-Ab复合物本身，而测定复合物中的标记物，通过标记物的放大作用，进一步提高了免疫技术的敏感性。

三要素：通常在检测系统中会使用到一种叫标记物（labeling）的物质,常标记在抗体上 通常会有一个分离（separation）的过程在最后读取信号前

需要去仔细关注一下分析的模式（format）

3 标记免疫技术主要有哪几种？

主要经历了四种标记免疫技术的发展：荧光素(Fluorophores) – FIA

放射性同位素(Radioisotopes) – RIA

酶(Enzymes) – EIA

化学发光物质 - CLIA

4 ACCESS化学发光原理？

分析方法及过程

ACCESS系统采用磁性微粒作为固相载体，以AMPPD作为发光剂，固相载体的应用扩大了测定的范围。以竞争法、夹心法等免疫测定方法为基础。试剂包装采用特殊的设计，每个试剂包有5个小室分别把不同的试剂分开，减少了交叉污染，保证了检测质量。

⑴、抗原抗体结合：将包被单克隆抗体的顺磁性微粒和待测标本加入反应管中，标本中的抗原与微粒子表面的抗体结合，再加入碱性磷酸酶标记的抗体，经温育后形成固相包被抗体-抗原-酶标记抗体复合物。

⑵、洗涤、分离：在电磁场中进行3次洗涤，很快将未结合的多余抗原和酶标记抗体洗去。

⑶、加入底物AMPPD发光剂：AMPPD被结合在磁性粒子表面的碱性磷酸酶的催化下迅速去磷酸基因，生成不稳定的中介体 AMPD。AMPD很快分解，从高能激发态回到低能量的稳定态，同时发射出光子，这种化学发光持续而稳定，可达数小时之久。通过 光量子阅读系统记录发光强度，并从标准曲线上计算出待测抗原的浓度。

3化学发光项目的免疫学原理？

· 抗原、抗体特异性结合

· 小分子采用(一步、二步)竞争结合法：

一步竟争法：Total T4, Cortisol, T Uptake, Digoxin, Theophylline, Total T3

二步竟争法: FT4, B12, Folate, FT3

大分子采用(一步、二步)夹心法：ßhCG， hTSH ，Ferritin， Prolactin ，PSA ， CEA， hFSH

hLH IgE

4一步和二步分析法是怎么回事？

同步和分步是按照：试剂/样品加入的顺序，孵育的次数(步骤)，清洗分离的次数(步骤)来区分的，像一步分析法是试剂和样品同步加入，进行一次孵育一次清洗。像二步分析法是先加入样品进行孵育和清洗后再加入试剂，进行第二次孵育和清洗。

5什么是钩状效应（hook effect），如何判断及解决？

免疫测定的实质是抗原抗体反应，抗原抗体反应是按一定的分子比例结合，当二者比例适中时，形成的免疫反应最强烈，形成复合物或检测的信号与所测的抗原或抗体成比例关系，但当抗原或抗体其中一者过量时，免疫反应将减弱，测定值呈现假性低值。

在化学发光中像二步分析法一般都能避免钩状效应，对于一步夹心法项目说明书中都提到了产生钩状效应的上限如人绒毛膜促性腺激素的钩状效应值是100万mIU/ml.在实际工作中如遇到测定值与临床严重不符的结果要考虑到钩状效应，解决办法是稀释此样本。

6什么是嗜异性抗体？

病人样品中可能自然产生一些针对动物免疫球蛋白的抗体(通常是鼠或羊)，一般来源于暴露于这些动物或接受过动物血清的治疗，分析的干扰：可以在双单克隆夹心法分析模式中引起假阳性，可以在单克隆/多克隆分析模式中出现假阴性。

厂家在试剂生产中会加入封闭剂，封闭剂可以加在反应基质中或整合在试剂盒内：鼠 (鼠科类), 鸟 (鸟科类) 和羊蛋白，各个厂家生产的分析试剂都有可能会不同程度的受到任何一个病人血清的影响！当遇到与临床不符的结果时要询问病史看是否有嗜异性抗体的干扰。

7什么是基质效应？

基质是指的是样品中被分析物以外的组分。基质常常对分析物的分析过程有显著的干扰，并影响分析结果的准确性。目前最常用的去除基质效应的方法是，通过已知分析物浓度的标准样品，同时尽可能保持样品中基质不变，建立一个校正曲线（calibration curve）。

8稀释样品时稀释物不对为何有基质效应？

我们在稀释样品时要考虑到基质效应的影响，稀释必须在适当的基质中进行，对于大多数测定而言，适当的基质就是零校准品，如果分析物稀释基质效应中所含成分浓度不正确，稀释回收率就不能对它们进行准确的测定，因为它们稀释后会与Bing agent形成新的平衡。

9什么是AMPDD，化学结构，如何发光？

AMPPD是一种金刚基二螺[4，4]二氧己烷的磷酸酯。经ALP水解生成一种不稳定的阴离子，该阴离子分解时持续发光。发光强度稳定，与ALP量成比例。

化学式是4-甲氧基-4-（3-苯磷酸盐）螺-（1，2-二螺[4，4]二氧己烷-3，2’-金刚烷

10试剂盒中有哪几种试剂，作用都是什么？

有五个仓，以FRT4为例：

R1a: 包被着链霉亲和素的Dynabeads** 顺磁性微粒溶于TRIS 缓冲液[含有蛋

白质( 鸟类)、表面活性剂、0.125% NaN3和0.125% ProClin*** 300]。

R1b: 含蛋白质( 鸟类)、表面活性剂、< 0.1% NaN3和0.1% ProClin 300 的

TRIS 缓冲盐水。

R1c: 含蛋白质( 鸟类)、表面活性剂、0.125% NaN3和0.125% ProClin 300 的

TRIS 缓冲盐水。

R1d: 三碘甲状腺原氨酸- 碱性磷酸酶( 牛) 结合物溶于TRIS 缓冲液 [含蛋白

质( 鸟类)、表面活性剂、< 0.1% NaN3和0.1% ProClin 300]。

R1e: 结合了生物素的小鼠单克隆抗甲状腺素(T4) 溶于TRIS 缓冲液[含蛋白质

( 鸟类和鼠类)、表面活性剂、0.125% NaN3和0.125% ProClin 300]。

以该测试项目反应原理说明：

Access Free T4 测定是两步酶免法测定。将结合了生物素的单克隆抗甲状腺素(T4)抗体、样本、缓冲蛋白溶液以及包被着链霉亲和素的固相加至反应管中。在这首次温育过程中，结合了生物 素的抗T4 抗体与固相及样本内的游离T4 相结合。在反应管内温育完成后，结合在固相上的物