微生物实验模块一微生物多样性论文

图 ： 放 线 菌 菌 丝 的 一 般 形 态
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3.7 霉菌形态的显微观察 使用眼科镊将实验3.4马铃薯平板中的盖玻片夹起放置于一块干净的载玻片上，然
后用显微镜的高倍镜对插片培养基界面上下的霉菌菌丝结构以及子实体形态进行观察。 注意不同霉菌的菌丝分化结构以及子实体的差别如菌丝有无横格，足细胞，假根，孢 囊梗，分生孢子梗，孢囊，顶囊，帚状枝以及分生孢子形状等。并且将自土壤分离的 霉菌与实验室提供的标准霉菌示范片进行比较观察以发现差异。如图13所示。
1 马铃薯培养基 水体样液：库水:10-1，10-2, 湖水:10-2,10-3样液（本组为单号组库水） 2 牛肉膏蛋白胨培养基
图1：涂布示范图 3.1.2 菌种培养 将平板倒置放入培养箱内进行培养 牛肉膏蛋白胨培养基： 30℃ 24 hr 高氏一号培养基： 28℃ 1周 马铃薯培养基上： 28℃ 1周 3.1.3 细菌平板菌落的斜面转接
20ml牛肉膏蛋白胨的液体培养基中，摇瓶培养至对数期（12小时左右）。 2) 于正式上课前12小时采集护校河污水100mL。 3) 用无菌移液管取上述敏感细菌培养液5ml于盛有50ml 3×牛肉膏蛋白胨液体培养液
的三角瓶内，37℃培养5小时后加入100ml环境污水样品，37℃继续摇瓶培养12小 时以增殖噬菌体。 2.2.3 实验仪器及用具 加样枪、离心管、酒精灯、显微镜/载玻片、接种环、解剖针、解剖刀、镜台测微 尺、目镜测微尺、血球计数板、细菌过滤器，普通离心机； 革兰氏染色液一套、黑色素、碱性品红染液;插片培养的放线菌平板与霉菌平板； 曲霉，青霉，根霉示范片；酿酒酵母菌悬液；液体牛肉膏蛋白胨培养基，牛肉膏蛋白 胨琼脂半固体上层培养基，牛肉膏蛋白胨琼脂固体底层培养基;
图 13 霉菌的根丝的示意图
3.8 测定酵母菌细胞的大小 3.8.1认识测微尺的构造：
显微镜测微尺是由目镜测微尺和镜台接物测微尺组成，目镜测微尺是一块圆形玻 璃片，其中有精确的等分刻度，在5mm刻尺上分50份(图示)目镜测微尺每格实际代表 的长度随使用接目镜和接物镜的放大倍数而改变，因此在使用前必须用镜台测微尺进 行标定。
做霉菌划线转接，平板选择马铃薯培养基，方法同上。
图 5 插片示意图
3.5 细菌革兰氏染色和观察
3.5.1 操作步骤
制片：在一干净载玻片上的三个区域各滴加一小滴蒸馏水，分别挑取实验一细菌分 离平板上的单个菌落和标准革兰氏阳性（金黄色葡萄球菌）与革兰氏阴性细菌（大肠 杆菌）斜面的少量菌苔与上述三个区域的水滴混合，均匀涂开制作成薄薄的细菌涂片 将此细菌涂片在酒精灯上方通过2-3次，以使干燥的细菌样品能够被固定在载玻片上。 如图6所示。
水体微生物样品的稀释：将污水和洁净水, 分别稀释成10-1,10-2,10-3,10-4等系列。 倍比稀释操作为0.1ml 样液＋0.9ml无菌水。 2.2.2 口腔微生物的采集 取样：取一片载玻片，滴一小滴水，用无菌牙签在牙缝内反复擦拭几遍，然后将牙签
打散均匀涂布于载玻片上的水滴中。 2.2.3 污水样品的采集 1) 于正式上课前24小时培养敏感细菌：经活化的大肠杆菌固体斜面一支，接种一环至
③熟悉细菌芽孢和荚膜的染色方法； ④初步掌握平板菌落转接平板及固体斜面的菌种纯化方法; ⑤初步学习平板菌落计数以及活菌检测的方法。 1．3 放线菌与真菌的显微形态特征观察以及酵母细胞的显微测微和直接计数 ①掌握观察放线菌和丝状真菌以及酵母菌显微结构的基本方法； ②了解上述三类微生物的群落特征与细胞结构上的区别； ③掌握测定微生物细胞大小的测微技术； ④掌握对单细胞微生物进行显微直接计数的方法。 1．4 污水中大肠杆菌噬菌体的分离、纯化与观察 ①了解从环境污水中分离噬菌体的普通原理； ②熟悉并掌握噬菌体的扩增、培养与检测的实验方法； ③学习和掌握噬菌斑效价的测定方法。
3．4 放线菌与霉菌菌落的平板划线转接及盖片插片培养
首先在一个新鲜高氏一号平板的底部用记号笔将平板一分为二，选取实验一的高 氏一号培养基上放线菌得到良好分离的平板，用无菌接种环挑取 2 个不同形态放线菌 菌落分别划线接种于新鲜的高氏平板的两个区域，然后用无菌眼科镊以每个区域 5-6 片的数量将无菌盖玻片分别以 45 度角插入培养基上的划线轨迹约 3-4mm，放入 28℃ 正置培养，作为下一个实验的材料。
三、 实验方法及操作
3.1 样品的平板涂布和培养 3.1.1样品的平板涂布
微量取液器分别取0.1ml样品稀释液于固体培养基平板表面中央，用无菌的玻璃涂 棒将样品液滴均匀涂布分散在平板表面。如图1所示。（使用酒精灯制造无菌环境）
土壤样液：10-2,10-3样液（本组为单号组10-2） 1 牛肉膏蛋白胨培养基 1 高氏一号培养基
单细胞微生物
细菌
酵母菌
细 主胞 要 特 征菌
落
形态特征 相互关系 含水情况 外观特征
小而均匀、 个别有芽孢 单个分散或 按一定方式
排列 很湿或较湿
小而突起 或大而平坦
参
菌落透明度 菌落与培养基结合
度
透明或稍透 明
不结合
考
菌落的颜色
多样
特 菌落正反面颜色差
征
别
相同
细胞生长速度
一般很快
大而分化
单个分散或 假丝状 较湿
大而突起
稍透明 不结合
单调 相同 较快
气味
一般有臭味 多带酒香
菌丝状微生物
放线菌
霉菌ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
细而均匀
粗而分化
丝状交织 干燥或较干
燥 小而紧密
不透明 牢固结合 十分多样 一般不同
慢 常有泥腥味
丝状交织
干燥 大而疏松 或大而致密
不透明 较牢固结合
十分多样 一般不同 一般较快
霉味
表--1 不同微生物类群的主要菌落特征
取样→固定→沙黄染色2分钟→水洗至无色液→吸去残留水→酒精灯干燥
图2 :染色示范图 1.图片要均匀 2、固定菌体不可太烫（不烫手为宜） 3、染液要覆盖图菌区域
4、冲洗水流不可急，不能对着图片区域冲洗
第二步：显微镜油镜观察：（图3） 按照低倍-高倍-油镜的顺序进行观察。
光源亮度适中，光圈 75%左右，聚光 镜调至顶，干燥样品上滴加少许香 柏油，用 100 x 镜头对准光路，用 显微镜粗调将镜头与样品表面相 接，然后用细调往与粗调相反方向 调节直至出现 清晰的影响。 （镜头埋在香柏油里面）。使用完 用擦镜纸擦去镜头上的油。可用些 二甲苯
镜台测微尺为一专用中央有精确等分线的载玻片(图示），一般将长为1mm的直 线等分成100个小格，每格长0.0lmm即10μ m，是专用于校正目镜测微尺每格长度的。
图 14 镜台测微尺与目镜测微尺
3.8.2 目镜测微尺的校正： 刻度的一面朝下。将镜台测微尺放在显微镜的载物台上，使有刻度的一面朝上。
先用低倍镜观察，调焦距，待看清镜台测微尺的刻度后，转动目镜，使目镜测微尺的 刻度与镜台测微尺的刻度相平行，并使两尺左边的一条线重合，向右寻找另外一条两 尺相重合的直线 ，标定公式： 目镜测微尺每格长度 两条重合线间镜台测微尺的格数 两条重合线目镜测微尺的格数。
牛肉膏蛋白胨培养基需要下周每个班提前一天课前半小时转接斜面, 培养。 用无菌接种环挑取从环境中分离得到的平板单个菌落划线接种于牛肉膏蛋白胨的 试管斜面上，菌落任意挑选（被挑选的菌落在转接前用记号笔在平板底部作好标记， 以防混淆。被接种的细菌斜面做好标记，放置37℃培养箱内培养，第二天用于细菌染 色及形态学观察。 3.2 口腔微生物制片与观察 第一步：制片(单染色法)：（图2）
图 ： 荚 膜 染 色
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光学显微镜下的细菌鞭毛
图11 染色后的细菌鞭毛形态
3.6 观察放线菌气生菌丝和基内菌丝的区别 使用眼科镊将实验3.4高氏一号平板中的盖
玻片夹起放置于一块干净的载玻片上，然后用 显微镜的高倍镜对插片培养基界面以下的营养 菌丝以及培养基界面以上的孢子丝的形态进行 观察，如果孢子丝具有螺旋，注意孢子丝的螺 旋方向以及其它形态指标，这是放线菌的分类 鉴定依据之一。
一、 实验目的及意义
1．1 环境微生物采集与观察 ①了解环境与微生物的关系及其多样性； ②学习环境微生物（土壤、水体、人体等）采样的基本方法； ③初步掌握观察微生物的实验方法； ④了解光学显微镜显微观察的基本操作和油镜头的使用方法； ⑤了解并熟悉微生物的稀释涂布分离方法与技术； ⑥树立严格的无菌意识和掌握正确的无菌操作方法。 1．2 不同微生物类群菌落的比较及细菌多样性观察与鉴定 ①学习观察细菌、放线菌以及霉菌的群体形态及培养特征； ②了解革兰氏染色原理，掌握革兰氏染色技术；
图 3：油镜的使用
3.3 各种微生物菌落形态的识别 实验一的三种平板菌落培养特征观察；注意观察不同微生物菌落的形状，大小，
边缘，表面形貌，质地，颜色，光泽，干燥或湿润等性状。 ※ 上述平板菌落均需要进行计数和样品活菌数的计算
图4：不同形态的细菌菌落
四大类微生物形态和菌落特征比较
微生物类别 菌落特征
⑥结果判定：观察染色的分离细菌和实验标准细菌的颜色，蓝紫色为革兰氏阳性细菌， 红色为革兰氏阴性细菌。
图8 革兰氏染色法原理示意图
3.5.2 细菌的芽孢染色
图9 细菌芽孢（菌体染色，芽孢无色）
3.5.3 细菌的荚膜染色 1)制片与染色：无菌操作挑取一环硅酸盐细菌的液体培养物在载玻片上涂抹均匀，并
使其自然干燥。首先用碱性复红进行初染3分钟，洗去多余染液。然 后在载玻片的另一个区域滴加一滴印度墨汁，用另一块干净的载玻片 的短边将墨汁推向细菌样品液滴直至推到第一块载玻片的末端为止， 以形成一个均匀的墨汁与样品混合的推片，在空气中自然干燥或者用 吹风机的冷风将其吹干。 2)镜检：先高倍后油镜的顺序观察染色样品，可以观察到不被着色的荚膜形态。见图 10示意。
微生物多样性的调查与观察
生命科学学院
摘要：微生物在自然界是分布最广、种类最多的一类生物物种，因此对微生物 多样性的调查与观察有利于我们更好的了解认识我们身边的微生物世界。微生 物的形态特征包括个体形态与群体形态，个体形态主要通过显微镜以及染色技 术辨别其形态构造，而群体形态则是通过单个微生物细胞在固体培养基上经生 长繁殖后所形成的菌落（子细胞集合）来认识，菌落形态特征包括大小、颜色、 边缘、质地、表面形貌、湿润或干燥、光滑或皱褶、是否隆起，是否产生色素、 同心圆等。本次实验通过对取样、提纯、培养、染色（革兰氏染色）、计数 （血球计数板）、离心以及显微镜的使用等基本实验操作的学习，锻炼了实践 操作能力；通过对细菌，放线菌，霉菌，酵母菌，噬菌体的观察，使我们初步 接触了原核生物界，真核生物界以及病毒界，从而巩固了理论知识。 关键词：微生物，细菌，染色，观察
二、 实验材料和准备
2.2.1 环境微生物的采集与稀释 2.2.1.1 样品的采集： 空气中微生物采集：牛肉膏蛋白胨平板和马铃薯培养基，打开皿盖在空气中暴露
5min 使其与空气中微生物充分接触后盖上皿盖（室外和室内各 一个）。 土壤微生物采集：于南京师范大学植物园用土壤采样器进行五点对角取样，垂直取 15 cm 深度的土壤，取最前端 1 到 2cm 的土壤，将土样装入灭菌的信 封中封好，混匀。将土样带回实验室进行处理，称取 1g 土壤放入 含 9ml 无菌水的三角瓶中（内含玻璃珠数粒），振荡分散。 水体微生物采集：用水样采样器分别取采月湖污水和水库水约 500ml。 2.2.1.2 样品稀释 ： 土壤微生物样品的稀释： 称取1克土壤放入含9ml无菌水的三角瓶（内含玻璃珠数粒）， 混匀后用加样枪和Tips在离心管中进行10的倍比稀释成10-4,10-5,的梯度样品。
上，当看到流出的脱色液体变成无色时立即水洗去除残留的酒精溶液；
④复染：将沙黄染液滴加于细菌样品约2分钟，水洗干净后用吸水纸轻微擦去大滴水珠， 然后在酒精灯上方将样品的水分干燥；
⑤镜检：遵循低倍-高倍-油镜的顺序依次观察显微镜视野中的细菌样品，当使用油镜 观察时注意将显微镜的聚光镜提升至最高，光圈开启至75%以上，以便能清晰观察；
图
标准
待检
标准
6
：
G+
菌
G-
制
片
示
意
图
图 7 标准革兰氏染色制样示意图
染色： 1-2分钟后使用慢速水流（水流与载玻片的距离应尽量短，以免过大的水流势能将样品 冲走）将染液清洗掉并将样品周围的水滴用吸水纸擦干；
媒染：在样品上滴加卢戈氏碘液覆盖初染面以加强结晶紫的染色效果，1分钟后水洗 95%酒精滴加于经染色和媒染的样品