固定化酶催化反应过程wfw

固定化酶
2、固定化酶（固相酶或水不溶酶）：
通过物理或化学的方法使溶液酶转变为在一 定的空间内其运动受到约束（完全或局部） 的一种不溶于水，但仍具活性的酶。它以固 相状态作用于底物进行催化反应。
水溶性酶 水不溶性载体
固定化技术
水不溶性酶
（固定化酶）
3、固定化酶的研究历史
•固定化酶的研究从50年代开始，1953年德国的
② 固定化酶在生化制药中的应用:固定化的青霉素 酰化酶生产制造各种半合成的青霉素和头孢霉 素 ;固定化谷氨酸脱羧酶可以生产γ-氨基丁酸, 制成了CO2电极,可用于测定谷氨酸的含量。
③ 固定化酶在医学上的应用:固定化纤溶酶治疗血 栓,用固定化脲酶和微胶囊活性炭ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ成人工肾等
④ 固定化酶在分析检测和环境保护中的应用
离子结合法：酶通过离子键结合于具有离子交换基的 水不溶性载体的固定化方法。
载体 : 多糖类离子交换剂和合成高分子离子交换树脂。 DEAE 纤维素、 GM 纤 维素等。 特点 : 操作简单，条件温和，酶活回收率较高 , 受缓冲液种类或 pH 的影响， 易从载体上脱落。
共价结合法：酶以共价键结合于载体的固定化方 法，是载体结合法中应用最多的一种。
Grubhofer和Schleith采用聚氨基苯乙烯树脂为载体与羧
肽酶、淀粉酶、胃蛋白酶、核糖核酸酶等结合，制成固 定化酶。 •60年代后期，固定化技术迅速发展起来。1969年，日本 的千烟一郎首次在工业上生产应用固定化氨基酰化酶从
DL-氨基酸连续生产L-氨基酸，实现了酶应用史上的一大
变革。 •在1971年召开的第一次国际酶工程学术会议上，确定固 定化酶的统一英文名称为Immobilized enzyme。
§、概述:
1、水溶性酶应用过程中的一些不足
• 酶的稳定性较差：除了某些耐高温的酶(如α-淀粉酶、Taq酶等)及可 以耐受较低的pH条件(胃蛋白酶等)以外，大多数的酶在高温、强酸、 强碱和重金属离子等外界因素影响下，都容易变性失活。 • 酶的一次性使用：酶一般都是在溶液中与底物反应，这样酶在反应系 统中，与底物和产物混在一起，反应结束后，即使酶仍有很高的活力， 也难于回收利用。这种一次性使用酶的方式，不仅使生产成本提高， 而且难于连续化生产。 • 产物的分离纯化较困难：酶反应后成为杂质与产物混在一起，无疑给 产物的进一步的分离纯化带来一定的困难。
4、固定化酶的优缺点：
优点:
(1) 在催化反应以后，固定化酶容易从反应系统 中分离出来，可以反复使用，固定化后的酶 大多数情况下其稳定性增加. (2) 产物不受污染,容易精制; (3)固定化酶有一定的形状和机械强度，可以装 填在反应器中长期使用，便于实现生产连续 化和自动化。 缺点： (1)存在扩散限制。适于催化小分子物质。 (2)酶活性下降。
脂质体包埋：这是一种采用表面活性剂和磷脂酰胆碱等物质，形成液膜来
包埋酶的方法。脂质体是指具有脂双层结构和一定包囊空间的微球体, 具
有一定的机械性能，能定向将酶等被包裹物携带到体内特定部位，然后 将被包裹物质释放。因此，其在药物应用方面受到重视。
6、固定化酶的制备方法:
——载体结合法、交联法、包埋法. 1）载体结合法：将酶结合于水不溶性载体的 一种固定化方法。 物理吸附法 结合的形式 离子结合法 共价结合法
物理吸附法：酶被物理吸附(氢键,疏水键)于不溶 性载体的一种固定化方法。
载体:活性炭、多孔玻璃、氧化铝、硅胶、淀粉、合成树脂等。 特点:酶活性中心不易被破坏，酶结构变化少，酶与载体相互作用力弱， 酶易脱落。
用双功能或多功能试剂使酶与酶之间交联的固 定化方法。它是利用共价键固定酶的，它不使用 载体。
交联剂:形成希夫碱的戊二醛、形成肽键的异氰酸酯、发生 重氮偶合反应的双重氮联苯胺等。 特点 : 结合牢固，可以长时间使用 , 反应条件较激烈、酶活 回收率低,颗粒较小,使用不便。
可将交联法与吸附法或包埋法联合使用，以取长补短。
微囊型
特点 : 固定化酶颗粒一般为直径 是几微米到几百微米的球状体，比 网格型颗粒小得多 , 有利于底物和 产物扩散 ; 半透膜能阻止蛋白质分 子渗漏和进入，注入体内既可避免 引起免疫过敏反应，也可使酶免遭 蛋白水解酶的降解，具有较大的医 学价值.但反应条件要求高，制备成 本也高。
制备方法 : 界面沉淀法、界 面聚合法、二级乳化法和脂质 体包埋法等.
5、固定化酶应用:
① 固定化酶在工业生产中的应用:
固定化氨基酸酰化酶生产L-氨基酸;
乙酰 -DL — Ala L — Ala +乙酸 乙酰 -D — Ala
A-LAla A-DAla
泵
固定 化酶 柱子
储 罐
离心 机
L-Ala A-DAla
反应 产物
消 旋 反 应 器
晶体 LAla
固定化葡萄糖异构酶生产 高果糖浆---世界上生产规 模最大，应用最为成功的 一种固定化酶.
3）包埋法
——网格型和微囊型两种。 将酶包埋在高分子凝胶细微网格中的称为网格 型；将酶包埋在高分子半透膜中的称为微囊型。
特点:酶的高级结构改变少，酶活回收率较高，包埋法 只适合作用于小分子底物和产物的酶，因为只有小分子 才可以通过高分子凝胶的网格进行扩散。
适于网格型的高分子化合物有聚丙烯酰胺、聚 乙烯醇、淀粉、明胶、海藻酸等。
将载体有关基团活化，与酶有关基团发生偶联反应；或在载 体上接一个双功能试剂，然后将酶偶联上去。可与载体结合的 酶的功能团有氨基、羧基、羟基、酚基等。代表性的方法有重 氮法、溴化氰法等。 特点:反应条件比较苛刻，操作复杂，并引起酶高级结构产生 变化，破坏了部分活性中心，酶活回收率为30％左右。
2）交联法：
(生物传感器是由生物活性物质与换能器组成的分析系统, 可以简便、快速地测定各种特异性很强的物质 )
• 固定化葡萄糖氧化酶传感器是其中应用最为广泛的一种, 将葡萄糖氧化酶、过氧化氢酶和一种显色剂一起固定在试 纸上,只要将该试纸浸入被检尿样中几秒钟就可以马上检 测出尿样的葡萄糖是否超标,从而断定该妇女是有血糖、 尿糖还是妊娠。 • 生化分析中最常用的H电极也绝大多数是固定化酶产品:固 定化青霉素酶电极 • 重组海洛因酯酶传感器检测违禁药品 • 用聚丙烯酰胺凝胶包埋细菌电极可快速测定污水中的BOD。