23流式细胞仪检测技术
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DNA分析诊断肿瘤
DNA非整倍体细胞峰 突出的四倍体细胞峰 SPF>15%
DNA倍体分析：
结合临床病理的形态学诊断，对一些恶性肿瘤进行早期诊 断，跟踪随访和早期治疗，大大提高一些肿瘤的治愈率和 生存率。尤其对一些细胞抽吸物、体液、组织液的脱落细 胞的分析，意义尤为重要。
增殖状态分析：
淋巴细胞双色分析
LeucoGATE：Back-Gating，准确圈定淋巴细 胞门，并评估门的有效性
淋巴细胞双色分析
AIDS病人T细胞亚群分析
来自百度文库
FCM的应用——血液病学
白血病和淋巴瘤免疫分型 残留白血病 造血干细胞计数 PNH诊断 网织红细胞分析 血小板分析
血小板膜糖蛋白分子的表达 血小板活化 网织血小板分析
第23讲
流式细胞仪检测技术 （FCM）
EPICS XL 流式细胞分析仪
Dual Parameter Histograms
细胞组学研究的过去、现在和未来
18世纪，明视野显微镜发明 放射自显影 暗视野光镜，相差显微镜， 微分干涉对比显微镜，偏振 光显微镜，荧光显微镜 细胞成像定量分析系统 细胞计数仪
细胞周期分析——PI单染
细胞周期分析——ModiFit 分析
细胞周期分析——ModiFit 分析
大鼠生精细胞分析——PI单染
细胞凋亡—PI加Annexin V双染
PI
FITC-Annexin V
淋巴细胞亚群分析
FITC-CD4 PE-CD8
CY5.5-CD3
培养细胞表面粘附分子表达
培养细胞表面粘附分子表达
SimulTEST IMK-Lymphocyte 试剂盒
• CD45/CD14，Leucogate：确定淋巴细胞门，评估 门的有效性，并自动计算淋巴细胞亚群占门内淋 巴细胞的比例，排除门内杂细胞的干扰 • 1/2a，阴性对照：确定淋巴细胞的阴性界值，评 估实验的非特异染色 • CD3/CD19：分析T淋巴细胞和B淋巴细胞 • CD3/CD4：分析T辅助/诱导细胞 • CD3/CD8：分析T抑制/细胞毒性细胞 • CD3/CD16+56：分析T淋巴细胞和NK细胞
免疫系统疾病 免疫缺陷病，AIDS 移植病人排斥反应或移植物抗宿主反应的检测 肿瘤病人化疗后免疫力检测
淋巴细胞亚群分析
• 根据功能，淋巴细胞主要分为
• B淋巴细胞（CD19+），与体液免疫有关 • T淋巴细胞（CD3+），与细胞免疫有关
• 总T和总B可以用来判断某些免疫缺陷和自身免疫 性疾病
• NK细胞（CD3- CD16+ 56+），行使免疫监 控功能，能够介导对某些肿瘤细胞和病毒感 染细胞的细胞毒性作用。
FCM的应用——肿瘤学
• 细胞周期分析 • 细胞凋亡的分析 • 凋亡细胞的分析 • 凋亡相关蛋白的分析 • 肿瘤相关基因表达的研究 • 多药耐药基因的研究
细胞周期分析
G2 M
G1 细胞周期
G0
DNA分析
s
细 胞 数 量
G0G1
s
0 200 400 600
G2 M
800
1000
2N
4N
DNA分析的临床意义
FCM的应用——分子生物学
分选细胞后进行FISH 分选细胞后进行PCR 流式细胞免疫表型与聚合酶链反应及荧光 原位杂交（PCR-FISH）结合测定血液CD4 ＋细胞中HIV特异的DNA或RNA 流式荧光原位杂交（Flow-FISH）测定染 色体端粒长度
性别选择
细胞周期分析——PI单染
FCM的临床应用
HIV免疫分型，CD4绝对计数 白血病和淋巴瘤的免疫分型 肿瘤的细胞周期和倍体分析 网织红细胞计数 细胞移植的交叉配型和免疫状态监测 干细胞计数 残量白血病细胞检查 HLA-B27检查 血小板功能及相关疾病
FCM的科研应用
树突细胞研究 干细胞研究 癌症病人的多药耐药性 细胞动力学功能研究 环境微生物分析 流式细胞术与分子生物学研究
反映了肿瘤的生长速度和侵袭性
正常人骨髓细胞DNA分析(ModiFIT)
多发性骨髓瘤
FCM在肿瘤早期诊断和鉴别诊断中的作用
DNA非整倍体的出现可能是癌前病变发生早期癌 变的一个重要标志 在病理形态学不能做出诊断前可提供确切诊断信 息 DNA非整倍体的交界瘤应按恶性对待
形态学表现良性的肿瘤出现非整倍体提示恶变可 能
DNA指数可作为判断间叶组织肿瘤良恶性的辅助 指标
细胞凋亡分析
• 细胞凋亡与细胞坏死是两个不同的过程 • 细胞凋亡的主要检查手段
• 形态学检测 • Ladders实验 • 流式细胞术检测
• 与凋亡相关的病理过程
• HIV • 自身免疫性疾病 • 肿瘤
细胞凋亡分析
• 细胞凋亡的主要指标
• 细胞内酶改变：Caspase-3活化 • 细胞膜不对称性改变，磷脂酰丝氨酸外翻， 但仍然保持膜的完整性：Annexin V/PI • 细胞核DNA的断裂改变：TUNNEL实验（ APO-BRDU，APO-DIRECT）
研究对象为生物颗粒，如各种细胞、染色体、微生 物、及人工合成微球等
研究的微粒特性包括多种物理及生物学特征，并加 以定量
流式细胞仪的特点
•单个细胞/生物颗粒分析 •同时多参数、多荧光分析
•高通量检测/高速度
•定性/定量分析
10000个细胞/秒以上
•分选特定性状或功能的细胞 •可检测的样本种类多样 •(1)外周血，骨髓，细针穿刺，洗脱液，实体 组织，培养细胞 •(2)血清、血浆、培养上清、细胞裂解液
分光高度计，荧光高
度计，干涉光高度计
单光子共聚焦显微镜，多光
子共聚焦显微镜
流式细胞仪
目标细胞分选
大体荧光成像系统
???
流式细胞术
流式细胞术（Flow Cytometry, 简称FCM）是一种 可以快速、准确、客观，并且同时检测单个微粒 （通常是细胞）的多项特性的技术，同时可以对特 定群体加以分选
• 淋巴细胞免疫分型
• 淋巴细胞亚群分析 • CD4绝对计数
• HIV的诊断与研究
• 淋巴细胞 CD4/CD8分析 • CD4绝对计数 • T细胞活化
• 细胞移植的交叉配型和免疫状态监测
FCM的免疫学应用
• 免疫功能和免疫调控的研究 • 淋巴细胞和单核细胞的活化 • 细胞因子的研究 • 淋巴细胞的增殖 • 树突状细胞的研究 • HLA-B27检测
• 凋亡相关蛋白：
• Fas • Bcl-2
细胞凋亡—PI分析
调亡细胞
正常G0/G1期细胞
Events
PI - Fluorescence
细胞凋亡—Active Caspases-3
细胞凋亡—Caspases-3
细胞凋亡—Annexin V
细胞凋亡—Annexin V
细胞凋亡—BrdU
FCM的应用——免疫学
流动室
鞘液
荧光信号
聚焦的激光光束
分选
将目标细胞 分离并富集 ，进行后续 研究。 分选纯度 >99%
流式细胞仪显示图的种类
FSC和SSC
直方图
散点图
•把前向散射光图和侧 向散射光图的一维图 像在二维图像上投影， 便是我们平常所看到 的流式图。 •所以横坐标表示的是 细胞的直径大小；纵 坐标表示的是细胞的 复杂程度。 •两者相结合就能说明 细胞种类
免疫荧光
免疫荧光 免疫荧光 DNA染色 免疫荧光
橙色
橙红 红 橙红 深红
PerCP
TO
488
488
670
525
免疫荧光
RNA染色
红
绿
流式细胞术操作流程
样品 培养细胞 新鲜组织 石蜡包埋 单细胞 悬液
标记
荧光抗体
检测
表型测定
细胞分选
统计学
分析
继续 培养
FCM的检测范围
细胞结构 细胞大小 细胞粒度 细胞表面面积 核浆比例 DNA含量与细胞周 期 RNA含量 蛋白质含量 细胞功能 细胞表面/胞浆/核 的特异性抗原 细胞活性 细胞内细胞因子 酶活性 激素结合位点 细胞受体
作业： 举例流式细胞术的应用
O(∩_∩)O谢谢
二维等高图和密度图
Pseudo 3D Plot
3D Plot
假三维图与三维图
常用荧光染料的特性
荧光染料 激发波长 (nm) FITC 488 发射波长(nm) 525 用途 免疫荧光 颜色 绿色
PE(RD1)
ECD PeCy5 PI PECy7
488
488 488 488 488
575
620 675 620 755
淋巴细胞亚群分析
• 使用特异的单克隆抗体，进行多色分析， 同时分析淋巴细胞上多种抗原的表达，可 以将淋巴细胞亚群区分开，进行定量分析 • 各淋巴细胞亚群的百分含量 • 淋巴细胞亚群的绝对计数
临床意义
• • • •
• • • •
了解在不同情况下体内免疫功能状态 辅助临床疾病的诊断 探索疾病的发病机理、病程、预后 监测、指导临床治疗方案
目前流式细胞仪可以检测的类别
淋巴细胞 浮游生物 细菌 红细胞
DM：0.2μ m ——15μ m
单核细胞 中性粒细胞
流式细胞仪的基本构造
流动室与液流系统：将
细胞单个压入流动室
信号收集与数据 处理系统
光学滤镜
侧向散射光检测器 激光发射器
发出所需要的波长的激光
光源与光学系统
前向散射光检测器
Injector Tip
DNA非整倍体细胞峰 突出的四倍体细胞峰 SPF>15%
DNA倍体分析：
结合临床病理的形态学诊断，对一些恶性肿瘤进行早期诊 断，跟踪随访和早期治疗，大大提高一些肿瘤的治愈率和 生存率。尤其对一些细胞抽吸物、体液、组织液的脱落细 胞的分析，意义尤为重要。
增殖状态分析：
淋巴细胞双色分析
LeucoGATE：Back-Gating，准确圈定淋巴细 胞门，并评估门的有效性
淋巴细胞双色分析
AIDS病人T细胞亚群分析
来自百度文库
FCM的应用——血液病学
白血病和淋巴瘤免疫分型 残留白血病 造血干细胞计数 PNH诊断 网织红细胞分析 血小板分析
血小板膜糖蛋白分子的表达 血小板活化 网织血小板分析
第23讲
流式细胞仪检测技术 （FCM）
EPICS XL 流式细胞分析仪
Dual Parameter Histograms
细胞组学研究的过去、现在和未来
18世纪，明视野显微镜发明 放射自显影 暗视野光镜，相差显微镜， 微分干涉对比显微镜，偏振 光显微镜，荧光显微镜 细胞成像定量分析系统 细胞计数仪
细胞周期分析——PI单染
细胞周期分析——ModiFit 分析
细胞周期分析——ModiFit 分析
大鼠生精细胞分析——PI单染
细胞凋亡—PI加Annexin V双染
PI
FITC-Annexin V
淋巴细胞亚群分析
FITC-CD4 PE-CD8
CY5.5-CD3
培养细胞表面粘附分子表达
培养细胞表面粘附分子表达
SimulTEST IMK-Lymphocyte 试剂盒
• CD45/CD14，Leucogate：确定淋巴细胞门，评估 门的有效性，并自动计算淋巴细胞亚群占门内淋 巴细胞的比例，排除门内杂细胞的干扰 • 1/2a，阴性对照：确定淋巴细胞的阴性界值，评 估实验的非特异染色 • CD3/CD19：分析T淋巴细胞和B淋巴细胞 • CD3/CD4：分析T辅助/诱导细胞 • CD3/CD8：分析T抑制/细胞毒性细胞 • CD3/CD16+56：分析T淋巴细胞和NK细胞
免疫系统疾病 免疫缺陷病，AIDS 移植病人排斥反应或移植物抗宿主反应的检测 肿瘤病人化疗后免疫力检测
淋巴细胞亚群分析
• 根据功能，淋巴细胞主要分为
• B淋巴细胞（CD19+），与体液免疫有关 • T淋巴细胞（CD3+），与细胞免疫有关
• 总T和总B可以用来判断某些免疫缺陷和自身免疫 性疾病
• NK细胞（CD3- CD16+ 56+），行使免疫监 控功能，能够介导对某些肿瘤细胞和病毒感 染细胞的细胞毒性作用。
FCM的应用——肿瘤学
• 细胞周期分析 • 细胞凋亡的分析 • 凋亡细胞的分析 • 凋亡相关蛋白的分析 • 肿瘤相关基因表达的研究 • 多药耐药基因的研究
细胞周期分析
G2 M
G1 细胞周期
G0
DNA分析
s
细 胞 数 量
G0G1
s
0 200 400 600
G2 M
800
1000
2N
4N
DNA分析的临床意义
FCM的应用——分子生物学
分选细胞后进行FISH 分选细胞后进行PCR 流式细胞免疫表型与聚合酶链反应及荧光 原位杂交（PCR-FISH）结合测定血液CD4 ＋细胞中HIV特异的DNA或RNA 流式荧光原位杂交（Flow-FISH）测定染 色体端粒长度
性别选择
细胞周期分析——PI单染
FCM的临床应用
HIV免疫分型，CD4绝对计数 白血病和淋巴瘤的免疫分型 肿瘤的细胞周期和倍体分析 网织红细胞计数 细胞移植的交叉配型和免疫状态监测 干细胞计数 残量白血病细胞检查 HLA-B27检查 血小板功能及相关疾病
FCM的科研应用
树突细胞研究 干细胞研究 癌症病人的多药耐药性 细胞动力学功能研究 环境微生物分析 流式细胞术与分子生物学研究
反映了肿瘤的生长速度和侵袭性
正常人骨髓细胞DNA分析(ModiFIT)
多发性骨髓瘤
FCM在肿瘤早期诊断和鉴别诊断中的作用
DNA非整倍体的出现可能是癌前病变发生早期癌 变的一个重要标志 在病理形态学不能做出诊断前可提供确切诊断信 息 DNA非整倍体的交界瘤应按恶性对待
形态学表现良性的肿瘤出现非整倍体提示恶变可 能
DNA指数可作为判断间叶组织肿瘤良恶性的辅助 指标
细胞凋亡分析
• 细胞凋亡与细胞坏死是两个不同的过程 • 细胞凋亡的主要检查手段
• 形态学检测 • Ladders实验 • 流式细胞术检测
• 与凋亡相关的病理过程
• HIV • 自身免疫性疾病 • 肿瘤
细胞凋亡分析
• 细胞凋亡的主要指标
• 细胞内酶改变：Caspase-3活化 • 细胞膜不对称性改变，磷脂酰丝氨酸外翻， 但仍然保持膜的完整性：Annexin V/PI • 细胞核DNA的断裂改变：TUNNEL实验（ APO-BRDU，APO-DIRECT）
研究对象为生物颗粒，如各种细胞、染色体、微生 物、及人工合成微球等
研究的微粒特性包括多种物理及生物学特征，并加 以定量
流式细胞仪的特点
•单个细胞/生物颗粒分析 •同时多参数、多荧光分析
•高通量检测/高速度
•定性/定量分析
10000个细胞/秒以上
•分选特定性状或功能的细胞 •可检测的样本种类多样 •(1)外周血，骨髓，细针穿刺，洗脱液，实体 组织，培养细胞 •(2)血清、血浆、培养上清、细胞裂解液
分光高度计，荧光高
度计，干涉光高度计
单光子共聚焦显微镜，多光
子共聚焦显微镜
流式细胞仪
目标细胞分选
大体荧光成像系统
???
流式细胞术
流式细胞术（Flow Cytometry, 简称FCM）是一种 可以快速、准确、客观，并且同时检测单个微粒 （通常是细胞）的多项特性的技术，同时可以对特 定群体加以分选
• 淋巴细胞免疫分型
• 淋巴细胞亚群分析 • CD4绝对计数
• HIV的诊断与研究
• 淋巴细胞 CD4/CD8分析 • CD4绝对计数 • T细胞活化
• 细胞移植的交叉配型和免疫状态监测
FCM的免疫学应用
• 免疫功能和免疫调控的研究 • 淋巴细胞和单核细胞的活化 • 细胞因子的研究 • 淋巴细胞的增殖 • 树突状细胞的研究 • HLA-B27检测
• 凋亡相关蛋白：
• Fas • Bcl-2
细胞凋亡—PI分析
调亡细胞
正常G0/G1期细胞
Events
PI - Fluorescence
细胞凋亡—Active Caspases-3
细胞凋亡—Caspases-3
细胞凋亡—Annexin V
细胞凋亡—Annexin V
细胞凋亡—BrdU
FCM的应用——免疫学
流动室
鞘液
荧光信号
聚焦的激光光束
分选
将目标细胞 分离并富集 ，进行后续 研究。 分选纯度 >99%
流式细胞仪显示图的种类
FSC和SSC
直方图
散点图
•把前向散射光图和侧 向散射光图的一维图 像在二维图像上投影， 便是我们平常所看到 的流式图。 •所以横坐标表示的是 细胞的直径大小；纵 坐标表示的是细胞的 复杂程度。 •两者相结合就能说明 细胞种类
免疫荧光
免疫荧光 免疫荧光 DNA染色 免疫荧光
橙色
橙红 红 橙红 深红
PerCP
TO
488
488
670
525
免疫荧光
RNA染色
红
绿
流式细胞术操作流程
样品 培养细胞 新鲜组织 石蜡包埋 单细胞 悬液
标记
荧光抗体
检测
表型测定
细胞分选
统计学
分析
继续 培养
FCM的检测范围
细胞结构 细胞大小 细胞粒度 细胞表面面积 核浆比例 DNA含量与细胞周 期 RNA含量 蛋白质含量 细胞功能 细胞表面/胞浆/核 的特异性抗原 细胞活性 细胞内细胞因子 酶活性 激素结合位点 细胞受体
作业： 举例流式细胞术的应用
O(∩_∩)O谢谢
二维等高图和密度图
Pseudo 3D Plot
3D Plot
假三维图与三维图
常用荧光染料的特性
荧光染料 激发波长 (nm) FITC 488 发射波长(nm) 525 用途 免疫荧光 颜色 绿色
PE(RD1)
ECD PeCy5 PI PECy7
488
488 488 488 488
575
620 675 620 755
淋巴细胞亚群分析
• 使用特异的单克隆抗体，进行多色分析， 同时分析淋巴细胞上多种抗原的表达，可 以将淋巴细胞亚群区分开，进行定量分析 • 各淋巴细胞亚群的百分含量 • 淋巴细胞亚群的绝对计数
临床意义
• • • •
• • • •
了解在不同情况下体内免疫功能状态 辅助临床疾病的诊断 探索疾病的发病机理、病程、预后 监测、指导临床治疗方案
目前流式细胞仪可以检测的类别
淋巴细胞 浮游生物 细菌 红细胞
DM：0.2μ m ——15μ m
单核细胞 中性粒细胞
流式细胞仪的基本构造
流动室与液流系统：将
细胞单个压入流动室
信号收集与数据 处理系统
光学滤镜
侧向散射光检测器 激光发射器
发出所需要的波长的激光
光源与光学系统
前向散射光检测器
Injector Tip