三氯乙酸沉淀法

TCA/ 丙酮沉淀法

1、油菜黄化突变体蛋白质组分析：两种蛋白质提取方法比较

取叶片400 mg(去叶脉)置于研钵中，加入0.1 g PVP于液氮中碾成粉末．转入2.0 ml 离心管中并加入1.5 ml 于-20℃预冷的提取液(含10% TCA 和0.07% DTT 的丙酮溶液)，

-20℃沉淀过夜．于4℃，20 000 g 离心1 h，弃上清．沉淀悬浮于1.5 ml -20℃预冷的丙酮溶液(含10% TCA 和0.07%DTT)中，-20℃沉淀过夜．同上离心，重复洗涤沉淀3～4 次至蛋白质为乳白色．最后将沉淀真空冷冻干燥成干粉，于-80℃冰箱保存备用．

2甘蓝型油菜根系可溶性蛋白的提取及双向电泳体系的优化称取0. 5 g 根样于液氮预冷的研钵中, 加液氮研磨至粉

状，将粉末移至10 mL 离心管中, 加入10 倍体积的提取液( 10% T CA/ 丙酮，1 mmol/ L 苯甲基磺酰氟( PMSF) ,

0. 07% 2-巯基乙醇) , 涡旋震荡1 min, - 20℃静置2 h 或

过夜。然后在4℃下35 000 r/ min 离心15 min, 弃上清。

所得沉淀再用预冷的丙酮清洗3~ 5 次, - 20℃下冷

冻干燥备用。

3、适于水稻根、叶、悬浮细胞总蛋白质分析的高分辨率双向电泳方法

取1~ 2 g 材料于液氮中充分研磨, 加入10 mL 预冷的含10%三氯乙酸( TCA) 、0 . 07%DT T 的丙酮, 充分混合后-20℃

下放置1 h, 35 000×g 下离心15 min。在沉淀中加入10

mL 预冷的含0. 07% DT T 的丙酮, 充分混合, - 20℃下放置1 h, 12 000×g 下离心15 min, 重复该步骤2~ 3 遍。沉淀冷冻干燥( FREEZE DRYER 4. 5, LABCONCO, 美国) 后放于- 75℃下, 或直接进行下一步提取。取适量样品粉末, 按20μL/ mg 的比例加入蛋白裂解液( 9 mol/ L 尿素, 4% CHAPS,1%IPG 缓冲液, 1%DTT , 35 mmol/ L Tr is) , 30℃

水浴1 h, 并不时振荡, 12 000×g 下离心10 min。上清液中加入4 倍体积的预冷丙酮, 于- 20℃下放置至少2 h, 4 000×

g 下离心10min, 沉淀用水化缓冲液( 8 mol/ L 尿素, 2% CHAPS, 20mmol/ L DTT, 0. 5%IPG 缓冲液) 溶解, 重复该步骤1~ 2 遍。样品溶液存于- 75 下或直接用于电泳。4、TCA －丙酮沉淀法提取聚合草叶蛋白的研究

低温下将0．5 g 干叶粉或1 g 鲜叶充分研磨后转入离心管，称净重。加3．4 mL 丙酮溶液［－20℃，含10%( W/V) TCA 和0．07% ( V/V) 巯基乙醇］，涡旋振荡，－20 ℃放置2 h，5000 r/min，4℃离心40 min，弃上清，加入2 mL 含0．07%巯基乙醇的丙酮，－20 ℃放置1 h，离心重复洗涤沉淀至无色，沉淀经真空冷冻干燥。