流式细胞术的原理及应用
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36
Principle of Flow Cytometry
Alive or fixed cells in single cells suspension
Sheath fluid
vibrating flow cell
Laser
Red fluorescence
cell sorting
Green fluorescence
Flow cell
Dichroic Filters
PMT
1
PMT
2
Bandpass Filters
PMT
3
Laser
38
39
常用荧光染料的特性
荧光染料 激发波长 (nm)
FITC
488
PE(RD1) 488
ECD
488
PeCy5 488
PI
488
PECy7 488
PerCP 488
APC
633
发射波长(nm) 用途
9
流式细胞仪的 工作原理
10
FCM的工作系统
1.液流系统： 细胞悬液被吸入检测室后，在鞘液
(sheath)的约束下，通过喷嘴，使其形成单细 胞悬液。
11
2.光学系统： 激光是较常用的光源, 稳定性好、单色性好。 散射光和荧光信号被收集、处理转化为数字信号。
3.数据处理系统： 对实验数据分析、存储、显示。 具有智能化、自动化特点。
57
同型对照：为阴性对照；实验中选用的大鼠或小 鼠源性标记单抗，就一定选用相同源性的标记单 抗作为同型对照来调整设置电流电压。 上机前一般需过目：200-300目 全程质控：从样品制备和标记、溶血、洗涤、仪 器质控和上机检测，需全程质控。
长通滤片——允许长于设定波长的光通过 短通滤片——允许短于设定波长的光通过 带通滤片——允许一定带宽—波长的光通过 二向色性滤片——当以 45o 角放置滤片时,该滤片 可以通过一定波长的光,同时也可以阻断并折射该波 长以下的光
35
荧光信号
荧光素吸收激光能量 荧光素将吸收能量释放，转换为
振动能和热能 释放较入射光波长更长的光量子 荧光素与特异抗体结合 荧光抗体与细胞抗原结合越多，产生的荧光信号越强
530 580 630 680 730 780 Emission wavelength (nm)
52
荧光补偿方法
➢所有补偿调为“0” ➢调节电压，用同型对 照或阴性对照，使阴性 群位于“左下角” ➢依单阳群体调节荧光 补偿
53
流式细胞术样品制备的要求
制备单细胞悬液是流式细胞分析的基础。 标本应新鲜；采用密度梯度离心分离外周血淋巴细胞，在分 离和洗涤过程中应避免高速离心而致细胞膜结构破坏。 常用溶血剂处理红细胞。 温度和pH：25-370C，pH 7.0-7.2。 制备实体组织标本的单细胞悬液时多采用机械法，而少用化 学法或酶消化法。 被检细胞或颗粒大小0.2－80um 样品中至少20000个细胞，浓度105-107个/毫升
15
光学系统
入射光系统：激光 (Laser)是一种相干光源， 它能提供单一波长、单一方向、同步的稳定光 照。
发射光系统：散射光和荧光 光收集系统是由若干组透镜、滤波片和小孔组
成,将产生的光信号引导至检测器
16
入射光—激光光源
➢ 单波长、高强度、高稳定性 ➢ 多采用氩离子激光器或氦氖激光器 ➢ 一般选配2-4根激光，488nm 、633nm、355nm和
细胞大小
细胞粒度
细 细胞表面面积
胞 结
核浆比例
构 DNA含量与细胞周期
RNA含量
蛋白质含量
特异性抗原
（细胞表面/胞浆/核）
细 胞 功 能
细胞内细胞因子 细胞活性 酶活性
激素结合位点
细胞受体
8
流式细胞术发展简史
1934年，Moldavan开创流式细胞自动计数的基础。 1950s，Coulter公司设计细胞自动计数器，初步解 决了流动细胞的通路问题。 1965年，在细胞分选中应用了超声震动器。 1969年，Stanford、California大学的研究组发明 了第一台较满意的流式细胞仪。 1972年，FACS-І型仪器试制成功，并在美国建国200 周年纪念会上与人造卫星并列展示。
流式细胞术的原理及应用
临床实验诊断教研室 施琼
1
流式细胞术的概念
流式细胞术（Flow Cytometry, FC/MFACS）是 一种可以快速、准确、客观，并且同时检测单个 微粒（通常是细胞）的多项特性的技术，同时可 以对特定群体加以分选
研究对象为生物颗粒，如各种细胞、染色体、 微生物、及人工合成微球等
54
实验对照的设计
空白对照： 阴性对照：
常用同型抗体对照 单色分析：设同型抗体对照 多色分析：同型对照，单阳性对照（用于仪器校正）
阳性对照：检测阴性时
55
实验标本的处理
单细胞悬液的制备：胰酶消化 抗体或标记分子的染色：抗原抗体反应 非特异结合的去除：洗涤和封闭 封闭：血清和同型抗体
56
特别提醒注意
FACSCalibur 光路图
26
细胞分选系统
27
细胞分选的原理
当含细胞的液滴逐个通过激光束时，受到两种检 测器的检测:如果液滴中含有细胞就会激活干涉检测 器(interference detector)，只有带有荧光标记细 胞的液滴才会激活荧光检测器(fluorescence detector)。当带有荧光标记的液滴通过激光束时， 将两种检测器同时激活，引起液滴充电信号使鞘液 带上负电荷。由于液滴带有负电荷，移动时就会向 正极移动，进入到荧光标记细胞收集器中。
42
流式细胞仪数据分析（1）
直方图分析
X轴：代表荧光信号或 散射光信号的强度，用 “通道数”表示，可以 与光强度之间线性关系 或对数关系
Y轴：代表该通道内所 出现具有相同光信号特 征性细胞的频率
单参数直方图（Histogram）
43
流式细胞仪数据分析（2）
点图分析
二维点图Dot Plot
➢便于数据统计 ➢不同的细胞群 可以用不同的颜 色标记 ➢主要表达方式
19
散射光
它反应细胞的物理特性,根据前侧向散射光，可以把不同 类型的细胞群加以区分
FSC（小角散射光)它反 应细胞的相对大小和截 面积的大小
SSC (90度角散射光)代 表细胞的颗粒度和精细 结构的变化
全血细胞流式FSC-SSC图
20
Forward Angle Light Scatter
Laser
Purdue University Cytometry Laboratories
23
光收集系统：滤光片
Longpass
460 500 540
Shortpass
460 500 540
Bandpass
460 500 540
LP 500
SP 500
BP500/50
24
电子系统：光电倍增管（PMT）
25
44
流式细胞仪数据分析（3）
二维等高图和密度图
45
Pseudo 3D Plot
3D Plot
46
流式细胞仪的应用
47
临床研究
淋巴细胞亚群测定、血小板分析、网织红细胞分析 、白血病和淋巴瘤免疫分型、造血干细胞移植监测 、 HLA-B27分析、PNH诊断、人类同种异体器官移植 中应用、细胞因子测定、AIDS诊断与治疗和疗效评 价、flow-FISH法测定端粒长度
50
抗体的选择
首选直接标记抗体 根据仪器型号和抗原表达强弱合理选择荧光抗体
PE最强，适用于弱表达抗原 FITC最便宜，适用于强表达抗原 使用双标以上抗体必做荧光补偿
51
光谱交叉
4 colors - simultaneous collection
FITC
PE PETR
PE-CY5
两色以上荧 光分析存在 光谱交叉
4
BD LSR
5
FACS Vantage DiVa
科研型（大型机）
特点： ➢多数字化 ➢适用于各类细胞分选 ➢4路分选
6
FACSAria
科研型
特点： ➢分辨率高
➢选配多种波长和类 型激光器
➢可把感兴趣细胞分 选到特定培养孔或板 上（4路和24孔板）
➢适用于高速分选和 多色分析
7
流式细胞仪检测范围
电脉冲信号经A/D转换成数字信号 数字信号传送到计算机，进行储存、 作图、 统计分析
41
数据处理
检测数据的显示视测量参数的不同有多种形式 可供选择 ➢单参数数据 以直方图的形式表达，其X轴为测 量强度，Y轴为细胞数目。 ➢双参数或多参数数据 既可以单独显示每个参 数的直方图，也可以选择二维的散点图、等高线 图、灰度图或三维立体视图。
研究的微粒特性包括多种物理及生物学特征， 并加以定量
2
流式细胞仪特点
单细胞悬液或 生物颗粒 分析速度高
多参数
精度高
当代最先进的细胞 定量分析技术
3
FACS Calibur
特点：
➢光路调节系统固定
➢自动化程度高
➢操作简便
➢使用寿命长
➢配备1-2根激光
临床型（台式机）
➢细胞分选速度慢， 主要用于细胞分析
28
Fluorescence Activated Cell Sorting
488 nm laser
- Charged Plates
Single cells sorted into test tubes
FALS Sensor Fluorescence detector
+
29
信号检测--荧光信号
激发 激光
407nmUV激光 ➢ 最多检测13个荧光参数
17
18
发射光
散射光信号 前向散射光（foword scatter, FS）：在激
光束正前方的检测器，用于检测细胞或其他粒子 物体的表面属性，如大小、形状等。
侧向散射光（side scatter， SS）：与激光 束垂直方向的检测器为侧向检测器，主要用于检 测细胞内部结构属性，可获得细胞内超微结构和 颗粒性质的参数。 荧光信号
激发态
发射
能量损失 能量级
特异荧光
自发荧光特异荧3光0
前向散射光
Laser
FALS Sensor
31
前向散射光
32
Laser
侧向散射光
FALS Sensor
90LS Sensor
33
侧向散射光
34
光路——荧光信号
每种荧光染料都有特定的激发波长和发射波长，流 式细胞仪利用不同波长的光学滤片来检测这些特定 发射波长的光学信号。
12
流式细胞仪仪器结构
液流系统 光学系统
激光光源 光收集系统 电子系统 光电转换 数据处理系统 细胞分选系统
13
液流系统：流动室、液流驱动系统
Injector Tip
Sheath fluid
Fluorescence signals
Focused laser beam
14
液流中心由单列匀速运动颗粒组成的液柱
90o
SSC light scatter
(granularity)
forward light scatter (size) FSC
collection tubes
Computer for data analysis and
result display
37
P4 MT
4
Flow Cytometry Principle
激发波长 （nm）
488
发射波长（nm） 525、575
颜色 绿色、橙色
FITC+PeCy5
488
525、675
绿色、红色
FITC+ECD
488
525、625
绿色、橙红色
FITC+PE+PeCy5
488
525、575、675 绿色、橙色、红色
FITC+ECD+PeCy5 488
525、625、675 绿色、橙红色、红色
48
基础研究
淋巴细胞功能、树突状细胞（DC）研究、造血干细 胞研究、细胞周期分析、细胞凋亡分析、凋亡相关 蛋白分析、细胞功能研究、多药耐药基因研究（MDR ）、肿瘤相关基因表达研究、RNA测定、DNA测定、 总蛋白测定、癌基因和抑癌基因表达产物测定、血 管内皮细胞研究
49
常用免疫荧光染料组合
荧光染料 FITC+PE
525
免疫荧光
575
免疫荧光
620
免疫荧光
675
免疫荧光
620
ຫໍສະໝຸດ Baidu
DNA 染色
755
免疫荧光
670
670
颜色 绿色 橙色 橙红 红 橙红 深红
40
流式细胞仪的电子系统
进行信号检测和分析
当细胞携带荧光素标记物, 通过激光照射区时受到激发 , 产生不同波长的、代表细胞内不同物质的荧光信号
荧光信号由光电接收器接收，转变为电信号，可分析电 压脉冲的高度、面积和宽度
荧光染料浓度的控制：合适的荧光染料浓度是保证 最佳信号产生的重要技术指标。
1×106/ml细胞，用20µl荧光标记的单克隆抗体（ 0.1-1 µg/ ml)。 常用固定剂：细胞周期测定时应将细胞用PBS洗涤 三次后用70%冰乙醇固定，在40 C保存数月；荧光染 色后不能及时上机检测，可用1-4%多聚甲醛固定， 40 C保存。
FALS Sensor
21
Laser
90 Degree Light Scatter
FALS Sensor
90LS Sensor
22
Fluorescence Detectors
Laser
FALS Sensor
Freq
Fluorescence
Fluorescence detector (PMT3, PMT4 etc.)
Principle of Flow Cytometry
Alive or fixed cells in single cells suspension
Sheath fluid
vibrating flow cell
Laser
Red fluorescence
cell sorting
Green fluorescence
Flow cell
Dichroic Filters
PMT
1
PMT
2
Bandpass Filters
PMT
3
Laser
38
39
常用荧光染料的特性
荧光染料 激发波长 (nm)
FITC
488
PE(RD1) 488
ECD
488
PeCy5 488
PI
488
PECy7 488
PerCP 488
APC
633
发射波长(nm) 用途
9
流式细胞仪的 工作原理
10
FCM的工作系统
1.液流系统： 细胞悬液被吸入检测室后，在鞘液
(sheath)的约束下，通过喷嘴，使其形成单细 胞悬液。
11
2.光学系统： 激光是较常用的光源, 稳定性好、单色性好。 散射光和荧光信号被收集、处理转化为数字信号。
3.数据处理系统： 对实验数据分析、存储、显示。 具有智能化、自动化特点。
57
同型对照：为阴性对照；实验中选用的大鼠或小 鼠源性标记单抗，就一定选用相同源性的标记单 抗作为同型对照来调整设置电流电压。 上机前一般需过目：200-300目 全程质控：从样品制备和标记、溶血、洗涤、仪 器质控和上机检测，需全程质控。
长通滤片——允许长于设定波长的光通过 短通滤片——允许短于设定波长的光通过 带通滤片——允许一定带宽—波长的光通过 二向色性滤片——当以 45o 角放置滤片时,该滤片 可以通过一定波长的光,同时也可以阻断并折射该波 长以下的光
35
荧光信号
荧光素吸收激光能量 荧光素将吸收能量释放，转换为
振动能和热能 释放较入射光波长更长的光量子 荧光素与特异抗体结合 荧光抗体与细胞抗原结合越多，产生的荧光信号越强
530 580 630 680 730 780 Emission wavelength (nm)
52
荧光补偿方法
➢所有补偿调为“0” ➢调节电压，用同型对 照或阴性对照，使阴性 群位于“左下角” ➢依单阳群体调节荧光 补偿
53
流式细胞术样品制备的要求
制备单细胞悬液是流式细胞分析的基础。 标本应新鲜；采用密度梯度离心分离外周血淋巴细胞，在分 离和洗涤过程中应避免高速离心而致细胞膜结构破坏。 常用溶血剂处理红细胞。 温度和pH：25-370C，pH 7.0-7.2。 制备实体组织标本的单细胞悬液时多采用机械法，而少用化 学法或酶消化法。 被检细胞或颗粒大小0.2－80um 样品中至少20000个细胞，浓度105-107个/毫升
15
光学系统
入射光系统：激光 (Laser)是一种相干光源， 它能提供单一波长、单一方向、同步的稳定光 照。
发射光系统：散射光和荧光 光收集系统是由若干组透镜、滤波片和小孔组
成,将产生的光信号引导至检测器
16
入射光—激光光源
➢ 单波长、高强度、高稳定性 ➢ 多采用氩离子激光器或氦氖激光器 ➢ 一般选配2-4根激光，488nm 、633nm、355nm和
细胞大小
细胞粒度
细 细胞表面面积
胞 结
核浆比例
构 DNA含量与细胞周期
RNA含量
蛋白质含量
特异性抗原
（细胞表面/胞浆/核）
细 胞 功 能
细胞内细胞因子 细胞活性 酶活性
激素结合位点
细胞受体
8
流式细胞术发展简史
1934年，Moldavan开创流式细胞自动计数的基础。 1950s，Coulter公司设计细胞自动计数器，初步解 决了流动细胞的通路问题。 1965年，在细胞分选中应用了超声震动器。 1969年，Stanford、California大学的研究组发明 了第一台较满意的流式细胞仪。 1972年，FACS-І型仪器试制成功，并在美国建国200 周年纪念会上与人造卫星并列展示。
流式细胞术的原理及应用
临床实验诊断教研室 施琼
1
流式细胞术的概念
流式细胞术（Flow Cytometry, FC/MFACS）是 一种可以快速、准确、客观，并且同时检测单个 微粒（通常是细胞）的多项特性的技术，同时可 以对特定群体加以分选
研究对象为生物颗粒，如各种细胞、染色体、 微生物、及人工合成微球等
54
实验对照的设计
空白对照： 阴性对照：
常用同型抗体对照 单色分析：设同型抗体对照 多色分析：同型对照，单阳性对照（用于仪器校正）
阳性对照：检测阴性时
55
实验标本的处理
单细胞悬液的制备：胰酶消化 抗体或标记分子的染色：抗原抗体反应 非特异结合的去除：洗涤和封闭 封闭：血清和同型抗体
56
特别提醒注意
FACSCalibur 光路图
26
细胞分选系统
27
细胞分选的原理
当含细胞的液滴逐个通过激光束时，受到两种检 测器的检测:如果液滴中含有细胞就会激活干涉检测 器(interference detector)，只有带有荧光标记细 胞的液滴才会激活荧光检测器(fluorescence detector)。当带有荧光标记的液滴通过激光束时， 将两种检测器同时激活，引起液滴充电信号使鞘液 带上负电荷。由于液滴带有负电荷，移动时就会向 正极移动，进入到荧光标记细胞收集器中。
42
流式细胞仪数据分析（1）
直方图分析
X轴：代表荧光信号或 散射光信号的强度，用 “通道数”表示，可以 与光强度之间线性关系 或对数关系
Y轴：代表该通道内所 出现具有相同光信号特 征性细胞的频率
单参数直方图（Histogram）
43
流式细胞仪数据分析（2）
点图分析
二维点图Dot Plot
➢便于数据统计 ➢不同的细胞群 可以用不同的颜 色标记 ➢主要表达方式
19
散射光
它反应细胞的物理特性,根据前侧向散射光，可以把不同 类型的细胞群加以区分
FSC（小角散射光)它反 应细胞的相对大小和截 面积的大小
SSC (90度角散射光)代 表细胞的颗粒度和精细 结构的变化
全血细胞流式FSC-SSC图
20
Forward Angle Light Scatter
Laser
Purdue University Cytometry Laboratories
23
光收集系统：滤光片
Longpass
460 500 540
Shortpass
460 500 540
Bandpass
460 500 540
LP 500
SP 500
BP500/50
24
电子系统：光电倍增管（PMT）
25
44
流式细胞仪数据分析（3）
二维等高图和密度图
45
Pseudo 3D Plot
3D Plot
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流式细胞仪的应用
47
临床研究
淋巴细胞亚群测定、血小板分析、网织红细胞分析 、白血病和淋巴瘤免疫分型、造血干细胞移植监测 、 HLA-B27分析、PNH诊断、人类同种异体器官移植 中应用、细胞因子测定、AIDS诊断与治疗和疗效评 价、flow-FISH法测定端粒长度
50
抗体的选择
首选直接标记抗体 根据仪器型号和抗原表达强弱合理选择荧光抗体
PE最强，适用于弱表达抗原 FITC最便宜，适用于强表达抗原 使用双标以上抗体必做荧光补偿
51
光谱交叉
4 colors - simultaneous collection
FITC
PE PETR
PE-CY5
两色以上荧 光分析存在 光谱交叉
4
BD LSR
5
FACS Vantage DiVa
科研型（大型机）
特点： ➢多数字化 ➢适用于各类细胞分选 ➢4路分选
6
FACSAria
科研型
特点： ➢分辨率高
➢选配多种波长和类 型激光器
➢可把感兴趣细胞分 选到特定培养孔或板 上（4路和24孔板）
➢适用于高速分选和 多色分析
7
流式细胞仪检测范围
电脉冲信号经A/D转换成数字信号 数字信号传送到计算机，进行储存、 作图、 统计分析
41
数据处理
检测数据的显示视测量参数的不同有多种形式 可供选择 ➢单参数数据 以直方图的形式表达，其X轴为测 量强度，Y轴为细胞数目。 ➢双参数或多参数数据 既可以单独显示每个参 数的直方图，也可以选择二维的散点图、等高线 图、灰度图或三维立体视图。
研究的微粒特性包括多种物理及生物学特征， 并加以定量
2
流式细胞仪特点
单细胞悬液或 生物颗粒 分析速度高
多参数
精度高
当代最先进的细胞 定量分析技术
3
FACS Calibur
特点：
➢光路调节系统固定
➢自动化程度高
➢操作简便
➢使用寿命长
➢配备1-2根激光
临床型（台式机）
➢细胞分选速度慢， 主要用于细胞分析
28
Fluorescence Activated Cell Sorting
488 nm laser
- Charged Plates
Single cells sorted into test tubes
FALS Sensor Fluorescence detector
+
29
信号检测--荧光信号
激发 激光
407nmUV激光 ➢ 最多检测13个荧光参数
17
18
发射光
散射光信号 前向散射光（foword scatter, FS）：在激
光束正前方的检测器，用于检测细胞或其他粒子 物体的表面属性，如大小、形状等。
侧向散射光（side scatter， SS）：与激光 束垂直方向的检测器为侧向检测器，主要用于检 测细胞内部结构属性，可获得细胞内超微结构和 颗粒性质的参数。 荧光信号
激发态
发射
能量损失 能量级
特异荧光
自发荧光特异荧3光0
前向散射光
Laser
FALS Sensor
31
前向散射光
32
Laser
侧向散射光
FALS Sensor
90LS Sensor
33
侧向散射光
34
光路——荧光信号
每种荧光染料都有特定的激发波长和发射波长，流 式细胞仪利用不同波长的光学滤片来检测这些特定 发射波长的光学信号。
12
流式细胞仪仪器结构
液流系统 光学系统
激光光源 光收集系统 电子系统 光电转换 数据处理系统 细胞分选系统
13
液流系统：流动室、液流驱动系统
Injector Tip
Sheath fluid
Fluorescence signals
Focused laser beam
14
液流中心由单列匀速运动颗粒组成的液柱
90o
SSC light scatter
(granularity)
forward light scatter (size) FSC
collection tubes
Computer for data analysis and
result display
37
P4 MT
4
Flow Cytometry Principle
激发波长 （nm）
488
发射波长（nm） 525、575
颜色 绿色、橙色
FITC+PeCy5
488
525、675
绿色、红色
FITC+ECD
488
525、625
绿色、橙红色
FITC+PE+PeCy5
488
525、575、675 绿色、橙色、红色
FITC+ECD+PeCy5 488
525、625、675 绿色、橙红色、红色
48
基础研究
淋巴细胞功能、树突状细胞（DC）研究、造血干细 胞研究、细胞周期分析、细胞凋亡分析、凋亡相关 蛋白分析、细胞功能研究、多药耐药基因研究（MDR ）、肿瘤相关基因表达研究、RNA测定、DNA测定、 总蛋白测定、癌基因和抑癌基因表达产物测定、血 管内皮细胞研究
49
常用免疫荧光染料组合
荧光染料 FITC+PE
525
免疫荧光
575
免疫荧光
620
免疫荧光
675
免疫荧光
620
ຫໍສະໝຸດ Baidu
DNA 染色
755
免疫荧光
670
670
颜色 绿色 橙色 橙红 红 橙红 深红
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流式细胞仪的电子系统
进行信号检测和分析
当细胞携带荧光素标记物, 通过激光照射区时受到激发 , 产生不同波长的、代表细胞内不同物质的荧光信号
荧光信号由光电接收器接收，转变为电信号，可分析电 压脉冲的高度、面积和宽度
荧光染料浓度的控制：合适的荧光染料浓度是保证 最佳信号产生的重要技术指标。
1×106/ml细胞，用20µl荧光标记的单克隆抗体（ 0.1-1 µg/ ml)。 常用固定剂：细胞周期测定时应将细胞用PBS洗涤 三次后用70%冰乙醇固定，在40 C保存数月；荧光染 色后不能及时上机检测，可用1-4%多聚甲醛固定， 40 C保存。
FALS Sensor
21
Laser
90 Degree Light Scatter
FALS Sensor
90LS Sensor
22
Fluorescence Detectors
Laser
FALS Sensor
Freq
Fluorescence
Fluorescence detector (PMT3, PMT4 etc.)