血清白蛋白的分离与纯化、蛋白定量测定

实验步骤

装柱：取一根1cm×2cm的层析柱垂直夹在铁架上，注入1cm高的0.02mol/L
pH6.5NH4Ac缓冲液。将已处理浸泡在0.02mol/L pH6.5NH4Ac缓冲液中的DEAE纤
维素搅成悬浮状(沉淀的纤维素与NH4Ac溶液体积比为1:2)，加入层析柱内，慢慢 打开底部出口，同时不断加入DEAE纤维素直至柱高10cm。

平衡：纤维素Hale Waihona Puke Baidu床上留有3cm高的溶液，将层析柱两头旋紧，接上恒流泵，用
0.02mol/L pH6.5NH4Ac缓冲液平衡20min(流速为1ml/min,层析柱两头要旋紧，防 止柱床流干)

洗脱：平衡完成后，旋下上塞，慢慢打开底口使纤维素床上的液面下降到与床面
相齐，夹住底口。将样品Ⅳ加到纤维素柱上，打开底口使样品Ⅳ进入到床体，直 到与床面相齐，吸1.0ml 0.02mol/L pH6.5NH4Ac溶液，沿柱壁慢慢加入纤维素床 面上(三次，操作同上)，洗净沾在柱壁上的蛋白液。在纤维素床面上加3cm高的 0.02mol/L pH6.5NH4Ac溶液，将层析柱两头柱塞旋紧，接上恒流泵，用 0.06~0.5mol/L pH6.5NH4Ac溶液进行梯度洗脱(流速为1ml/min)。Ⅰ室加入 0.06mol/L pH6.5NH4Ac溶液200ml，Ⅱ室加入0.5mol/L pH6.5NH4Ac溶液200ml。
NH3 pH<pI
|
+H+
+
NH3 pH=pI
|
+H+
+
NH2
pH>pI
|
溶液的pH>pI，生物大分子带负电荷，解离成负离子 溶液的pH<pI，生物大分子带正电荷，解离成正离子
人血清蛋白质的等电点及分子量
蛋白质 白蛋白 α1-球蛋白 等电点 4.88 5.06 分子量 69000 200000
α2-球蛋白
考马斯亮兰法测定蛋白质
实验原理：

考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度，是利用蛋白质与染料结合 的原理定量测定微量蛋白浓度的方法。这种蛋白质测定法 快速、灵敏、优点突出，因而得到广泛的应用。考马斯亮 蓝法是目前灵敏度最高的蛋白质定量方法。

考马斯亮兰G-250染料，在酸性溶液中与蛋白质结合，使 染料的最大吸收峰（max）位置由465 nm变为595 nm，溶 液颜色也由棕黑色变为兰色。研究发现，染料主要是与蛋 白质中的碱性氨基酸（特别是精氨酸）和芳香族氨基酸残 基结合。在595 nm下测定的吸光值A595，与蛋白质浓度成 正比。
实验步骤

1、标准方法
(1)具体测定按下表操作(待测样品的加样量见下表的第8、9、10管) 加入物(ml) 标准蛋白 1 0 2*2 0.01 3*2 0.02 4*2 0.04 5*2 0.06 6*2 0.08 7*2 0.10 8*2 9*2 10*2 -
待测蛋白
蒸馏水 考马斯亮蓝 试剂
0.1 5.0

离子交换剂
离子交换剂由基质、电荷基团（或称功能基团）和反离 子组成。基质一般是不溶性聚合物，如纤维素，交联葡聚糖， 交联琼脂糖等；
基质
电荷基团
反离子 阳离子交换剂
纤维素－O — CH2— COO-— Na＋ 树脂 －O
—
N+(CH3)2 — OH-
阴离子交换剂
离子交换剂的选择
考虑因素：
1.被分离物质带何种电荷 2.被分离物质分子的大小 大分子物质选用凝胶，其次选用纤维素 3.被分离物质所处的环境 4.被分离物质的物理化学性质 5.被分离物质的大概数量
血清白蛋白的分离与纯化、 蛋白定量测定
实验目的

掌握DEAE纤维素层析法分离纯化蛋白的方 法

掌握考马斯亮兰法测定蛋白质的原理
DEAE纤维素层析法分离纯化 白蛋白
离子交换层析基本原理

根据待分离物质带电性质不同的分离纯化 方法 以离子交换剂为固定相，特定的离子溶液 为流动相，依据各种离子或离子化合物与 离子交换剂的结合力不同进行分离纯化的 层析方式
β-球蛋白 γ-球蛋白
5.06
5.12 6.85-7.50
300000
9000-150000 156000-300000
实验原理

除去硫酸铵后的白蛋白在0.02mol/L醋酸铵缓冲液（pH 6.5）条件下，加 到DEAE纤维素柱上，此pH时， DEAE纤维素带正电荷。 改用0.06mol/L醋酸铵缓冲液（pH 6.5）后。在此pH与离子强度时， DEAE-纤维素带有正电荷，能吸附带负电荷的蛋白质如白蛋白（pI 4.9）。 带正电荷蛋白质如γ-球蛋白（pI约7.3），不被吸附故直接流出。用 0.06mol/L醋酸铵缓冲液洗脱吸附在离子交换柱上的少量β-球蛋白及α-球 蛋白。 将醋酸铵浓度提高至0.3mol/L，白蛋白被洗脱下来（尚混有少量α-球蛋 白）。 整个层析过程用紫外检测仪监测流出蛋白组分，用自动部分收集器收集， 用记录仪记录整个洗脱过程。
•对于两性蛋白而言，结合力取决于其等电点以及溶 液的pH值。
离子交换纯化原理
如果要分离纯化一种具有兼性离子特性的生物大分子， 其离子化的程度取决于它所在溶液中的净电荷。 生物分子带电荷与否，或带什么样的电荷，主要决定于溶液的 pH值。
-H+
R—CH—COOH R—CH—COO-
-H+
R—CH—COO-
0.09 5.0
0.08 5.0
0.06 5.0
0.04 5.0
0.02 5.0
0 5.0
0.02
0.08 5.0
0.04
0.06 5.0
0.06
0.04 5.0
边加边混匀，2-3分钟后，以1号管为空白对照，测定各样品在595nm处的光吸收值A595
注意事项：

最好在试剂加入后的5-20min内测定吸光值，因为这段时 间内颜色最稳定 测定中，蛋白-染料复合物会有少部分吸附在比色杯壁中， 不可使用石英比色皿(因不易洗去染色)，可用塑料或用玻 璃比色皿，使用后用95%的乙醇荡洗，以洗去染色。