抗体纯化大全

抗体得纯化

第一节硫酸铵沉淀法

基本原理

ﻫ硫酸铵沉淀法可用于从大量粗制剂中浓缩与部分纯化蛋白质、用此方法可以将主要得免疫球蛋白从样品中分离,就是免疫球蛋白分离得常用方法。高浓度得盐离子在蛋白质溶液中可与蛋白质竞争水分子,从而破坏蛋白质表面得水化膜,降低其溶解度,使之从溶液中沉淀出来、各种蛋白质得溶解度不同,因而可利用不同浓度得盐溶液来沉淀不同得蛋白质。这种方法称之为盐析。盐浓度通常用饱与度来表示。硫酸铵因其溶解度大,温度系数小与不易使蛋白质变性而应用最广。ﻫ

试剂及仪器ﻫ

·组织培养上清液、血清样品或腹水等

·硫酸铵(NH4)SＯ4

·饱与硫酸铵溶液(SAS)

ﻫ·蒸馏水

ﻫ· PBS(含0。2ｇ／L叠氮钠) (见附录一)ﻫﻫ·透析袋

ﻫ·超速离心机ﻫﻫ·ｐH计ﻫﻫ·磁力搅拌器

ﻫ实验步骤ﻫﻫ以腹水或组织培养上清液为例来介绍抗体得硫酸铵沉淀。各种不同得免疫球蛋白盐析所需硫酸铵得饱与度也不完全相同、通常用来分离抗体得硫酸铵饱与度为33％—５０%。

ﻫ一、配制饱与硫酸铵溶液(ＳＡＳ)ﻫ

将７6７g(NＨ4)2SO4 边搅拌边慢慢加到1升蒸馏水中。用氨水或硫酸调到pH7、0。此即饱与度为100%得硫酸铵溶液(４。1 mol/Ｌ, 25°C);ﻫ

其它不同饱与度硫酸铵溶液得配制见表1; ﻫﻫ二、沉淀

ﻫ1、样品(如腹水)20 000´ｇ离心3０ｍiｎ,除去细胞碎片;ﻫ

２、保留上清液并测量体积;ﻫ

3、边搅拌边慢慢加入等体积得SAＳ到上清液中,终浓度为1:1(ｖ/v);

4、将溶液放在磁力搅拌器上搅拌6小时或搅拌过夜(4°Ｃ),使蛋白质充分沉淀。

ﻫ三、透析

1、蛋白质溶液10 00０´g 离心30min(4°C)。弃上清保留沉淀;

2、将沉淀溶于少量(10-20ml)PBS—0、2g／L叠氮钠中、沉淀溶解后放入透析袋对ＰＢＳ-０、２g/L 叠氮钠透析24-４8小时(4°C),每隔３-６小时换透析缓冲液一次,以彻底除去硫

3、透析液离心,测定上清液中蛋白质含量。

酸氨;ﻫﻫ

应用提示ﻫ

一、先用较低浓度得硫酸氨预沉淀,除去样品中得杂蛋白、

1、边搅拌边慢慢加SAS到样品溶液中,使浓度为0、5:1 (v/v);

ﻫ２、将溶液放在磁力搅拌器上搅拌６小时或过夜(4°Ｃ);ﻫ

3、3000´g离心30 ｍiｎ(４°C),保留上清液;

4、上清液再加ＳＡS到0、5:1 (v／v),再次离心得到沉淀。将沉淀溶于PBS,同前透析,除去硫酸氨;

５、杂蛋白与欲纯化蛋白在硫酸氨溶液中溶解度差别很大时,用预沉淀除杂蛋白就是非常有效得;

ﻫ二、为避免体积过大,可用固体硫酸氨进行盐析(硫酸氨用量参考表１);

ﻫ三、硫酸氨沉淀法与层析技术结合使用,可得到更进一步纯化得抗体。ﻫﻫ参考文献ﻫ

1、Ｂｕrd,R、S。, Rａymonｄ,C、S., Ｒａｔz,Ｃ。Ａand Ｄunn, D.L (1993)

A ｒａpｉd procedｕre foｒｐuｒｉｆｙingＩｇＭmoｎoｃlonal aｎtibodies ｆroｍ

2、T、Ｇ。mｕrine aｓｃitｅs using a DＥAE– dｉsk、Hybridｏma１2, 13５.ﻫﻫ

库珀着,徐晓利主译《生物化学工具》人民卫生出版社出版(１980),353。

ﻫ(夏泉)

表1、室温下硫酸氨饱与度由起始浓度(Ｓ1)提高到终浓度(S2)时需加硫酸氨得量(g/L)ﻫﻫﻫﻫﻫ０%

10％

20％ﻫ

２5％

ﻫ30％ﻫ

%

ﻫ

35

33％ﻫﻫ

ﻫ

50

%

45％ﻫ

4０％ﻫﻫ

ﻫ

55％

60%

ﻫ65%

ﻫ70％

80％

７5％ﻫﻫ

ﻫ90％

５6 1１4 14４176 19６ 20９２43 277 31３351 39０43０4７2 516 56１6６2 ７67

ﻫ57 8611８1３7 15０1８３２16 25１2８8326 3６5 406 4４94９４５９2 649ﻫ

2959 78 9１12３１5518９２25 26２300 ３40 382 424 ５20 6１9

193０62 94 12 3049 61 9３１25 1５8 1９3230 ２67307 3４8390 485 58３ﻫﻫ

７１62198２３5 27３31４356 449 ５4６ﻫ

12 43 ７4 １０7142 177 2１4 ２52 29２３３3 ４２6 5２2

ﻫ31 63 9４12９164 200２３8 278319 411 506ﻫ

３163 9７132168 205 245 285 375 ４69

3２6599 13４171 ２10 250 ３3９431

3３66 １０1 137 176 ２1４302３92ﻫ

3３６７103１41 １79 264 3５3

ﻫ3４69 10５143 227 314

３4 70 107 1９0 27５

3572 153 2３7

ﻫ36 115１9８ﻫ

77 1５7

ﻫ79 ﻫﻫﻫ第二节DＥAE离子交换层析法ﻫﻫ基本原理

ﻫ离子交换层析就是蛋白质纯化得常规方法,与硫酸氨沈淀法联合使用可以非常有效地纯化抗体。

ﻫDＥＡE就是一种阴离子交换剂,当蛋白质溶液通过DEAE柱时,带负电荷得蛋白质可以被DEAＥ吸ﻫﻫ附,带正电荷得蛋白质则不被吸附而随溶液流出。纯化抗体时可选择pH值大于待纯化抗体等电

ﻫ点得缓冲液,此时抗体带负电荷可以通过电价键吸附于DEＡE离子交换剂上,然后用增加盐浓度ﻫ

得方法将抗体洗脱。可以用连续梯度法洗脱,也可以用不连续梯度(分段洗脱)法洗脱。本文以

ﻫ腹水中ｍAb得纯化为例来介绍此方法。ﻫ

试剂及仪器ﻫ

·抗体样品(小鼠腹水或经硫酸氨沉淀得抗体)

· DEAE离子交换剂(阴离子交换剂)ﻫ

·层析柱(2、５ｃｍÆ ´ 20 cm)

ﻫ·缓冲液A:２5mmol/L Tｒｉs—ＨCl ｐH ８、8 +35 mｍｏl／ＬNaCl

·缓冲液B:2５mmol/L Triｓ—ＨCl ｐH 8.8+70mmｏl /L NaCl

·缓冲液C:25mmoｌ／L Tris—HCｌｐH8.8 +50０ｍmｏl /ＬNaCl

ﻫ·缓冲液D:25mmol/L Trｉs-HClｐＨ8.8

· PＢS (见附录一)

ﻫ·透析袋(MW CＯ１0 000)

·磁力搅拌器

·蠕动泵与部分收集器ﻫ

·紫外检测仪

·梯度发生器