SNP分型技术

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人体许多表型差异、对药物或疾病的易感性等等都可 能与SNP有关。 心脏病、癌症、糖尿病、精神病等复杂性疾病是遗传 和环境综合作用的结果。目前，发现这些多基因疾病 微效基因最有力的方法是对病例组和对照组等位基因 频率进行统计学比较，SNP是这种分析很好的一种标 记。
SNP分型技术
该技术应用的前提是SNP的位点必须含有该限制内切酶的识 别位点，它是SNP筛查中最经典的方法之一。
PCR- RFLP
❖ 原理： ❖ 利用限制性内切酶的酶切位点的特异性，用限制
性内切酶作用于同一DNA片断，如果存在SNP位 点，酶切片断的长度和数量则会出现差异，根据 电泳的结果就可以判断是否SNP位点。
1
2
基于电泳的检测方法
PCR-RFLP PCR-SSCP
AS-PCR
基于荧光定量PCR 的检测方法
TaqMan探针法 HRM
3
直接测序法
4
其他检测方法
质谱分析 SNaPshot
LDR
PCR- RFLP
由于碱基的变异可能导致酶切点的消失或新的切点出现，从 而引起不同个体在用同一限制酶切时，DNA片段长度出现差 异，这种因内切酶切点变化所导致的DNA片段长度的差异， 称限制性片段长度多态性（restriction fragment length polymporphism, RFLP）。
单链构象多态性法 PCR- SSCP
保持在 单链状态
非变性 凝胶电泳
构象不同 呈现多态 性
单链构象多态性(SSCP)分析
1～4、7～9：野生型基因片段；5、6：两例Val384Asp携带者的样本，显示变异 的SSCP带型
等位基因特异 PCR ( AS-PCR)
原理： 根据 SNP位点设计特异性引物。其中特异链的3′末 端与 SNP位点的碱基互补(或相同) ，另一条普通 链按常规方法进行设计。 因为特异引物在一种基因型中有扩增产物，在另一 种基因型中没有扩增产物，用凝胶电泳就能够很容 易地分辨出扩增产物的有无，从而确定基因型。
等位基因特异 PCR ( AS-PCR)
TaqMan 技术
原理：
TaqMan 荧光探针是一种寡核苷酸探针，报告基团在探针的 5’末端，淬灭基团在3’末端。 PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探 针。PCR扩增时，探针酶切降解，报告基团和淬灭基团分离， 发出荧光信号。每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成， 实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。 如果探针与目标序列中存在错配碱基，就会影响其释放荧光 的强度，可以通过检测反应液中的荧光强度确定基因型
（引物、条件） 3、qRT-PCR 4、Sample Melt(结果检
查，HRM数据收集) 5、数据分析
HRM
HRM 敏感度
图6 5%-50%AA模板熔解曲线图
图7 50%-95%AA模板熔解曲线图
直接测序法
SNP分型的金标准
其他检测方法
质谱分析 SNaPshot 连接酶检测反应（LDR）
?
PCR扩增 目的片段
限制性内切酶 酶切目的片段
电泳分离
rs1800629
PCR- RFLP分析
wk.baidu.com
rs1800629 RFLP 结果
单链构象多态性法 PCR- SSCP
原理： 单链DNA在中性条件下会形成二级结构，不同的二 级结构在电泳中会出现不同的迁移率。 这种二级结构依赖于碱基的组成，单个碱基的改变 也会影响其构象，最终会导致在凝胶上迁移速度的 改变。 经PCR扩增的目的片段在单链状态下，因其单个碱 基差异，所形成的空间构象不同，其在非变性聚丙 稀酰胺凝胶中泳动速度不一样，从而显示出带型的 差异，即多态型
TaqMan 技术
HRM
HRM的主要原理是根据DNA序列的长度、GC含量以及碱基 互补性差异，应用高分辨率熔解曲线对样品进行分析，其 极高的温度均一性和温度分辨率使分辨精度可以达到对单个 碱基差异的区分。
The HRM Analysis Workflow
1、核酸提取与均一化 2、PCR设计与优化
SNP分型技术简介
SNP概念
单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP),主要是指 在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性。 SNP在人类基因组中广泛存在，平均每500～1000个碱基对中就 有1个，估计其总数可达300万个甚至更多。
包括单个碱基的转换、 颠换、插入和缺失等 转换：同型碱基之间 A-G 腺嘌呤-鸟嘌呤 T-C 胸腺嘧啶-胞嘧啶 颠换：嘌呤与嘧啶之间 A-T、A-C、C-G、G-T