免疫组化ABC法
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• （11）贴片，甘油封片
• 四、观察结果并分析
免疫组化ABC法
实验对照设置
对照染色的目的 ---排除假阴性和假阳性。
免疫组化ABC法
实验步骤
• 三、ABC法
• ⑴含1% Triton X-100和0.03 %H2O2的0.01 mol/L 磷酸盐缓冲液(PBS, pH7.4)室温15min； • ⑵含3%牛血清白蛋白(BSA, Sigma)和1%正常 羊血清(NGS, Vector)的0.01 mol/L PBS室温 30min；
免疫组化ABC法
实验步骤
• ⑶一抗室温孵育过夜。抗体用含3%牛 血清白蛋白(BSA，Sigma)和1%NGS的
0.01 mol/L Pຫໍສະໝຸດ BaiduS稀释(下同)；
• ⑷0.01 mol/L PBS 漂洗3次，每次5min; • ⑸生物素化二抗室温孵育2h;
免疫组化ABC法
实验步骤
• ⑹0.01 mol/L PBS 漂洗3次，每次5min;
HRP
步骤：三步法
优点：敏感性较高
特异性强 应用范围广
缺点：某些脏器存在内源性生物素干扰
Avidin与糖基、纤维组织、核酸及细胞膜中 磷脂有非特异反应
免疫组化ABC法
实验步骤
• 一、切片和脱蜡 • 切5-10微米的薄片，贴于载玻片上，脱蜡后 进行后续反应。步骤如下：
• （1）二甲苯脱蜡
• （2）梯度酒精水化（无水酒精、95%酒精、 90%酒精、85%酒精、80%酒精） • 二、微波修复抗原
⑺ABC(1:100, Vector) 室温2h; • ⑻0.01 mol/L PBS 漂洗3次，每次5min; ⑼含0.03%DAB和0.006% H2O2的Tris 盐酸缓冲液(TB, pH7.6)室温10~15 min。
免疫组化ABC法
实验步骤
• （10）0.01 mol/L PBS 漂洗3次，每次5min;
免疫组化 ABC法
一 ABC法 实验原理
组织抗原
第一抗体 第二抗体 HRP 生物素 亲和素
原理：酶标记Biotin形成酶素化
Biotin 酶 素 化 Biotin ＋ Avidin--- ABC复合物 抗 原 --- 特 异 抗 体 --Biotin 标 记 二 抗 --Avidin ● Biotin ●
• 四、观察结果并分析
免疫组化ABC法
实验对照设置
对照染色的目的 ---排除假阴性和假阳性。
免疫组化ABC法
实验步骤
• 三、ABC法
• ⑴含1% Triton X-100和0.03 %H2O2的0.01 mol/L 磷酸盐缓冲液(PBS, pH7.4)室温15min； • ⑵含3%牛血清白蛋白(BSA, Sigma)和1%正常 羊血清(NGS, Vector)的0.01 mol/L PBS室温 30min；
免疫组化ABC法
实验步骤
• ⑶一抗室温孵育过夜。抗体用含3%牛 血清白蛋白(BSA，Sigma)和1%NGS的
0.01 mol/L Pຫໍສະໝຸດ BaiduS稀释(下同)；
• ⑷0.01 mol/L PBS 漂洗3次，每次5min; • ⑸生物素化二抗室温孵育2h;
免疫组化ABC法
实验步骤
• ⑹0.01 mol/L PBS 漂洗3次，每次5min;
HRP
步骤：三步法
优点：敏感性较高
特异性强 应用范围广
缺点：某些脏器存在内源性生物素干扰
Avidin与糖基、纤维组织、核酸及细胞膜中 磷脂有非特异反应
免疫组化ABC法
实验步骤
• 一、切片和脱蜡 • 切5-10微米的薄片，贴于载玻片上，脱蜡后 进行后续反应。步骤如下：
• （1）二甲苯脱蜡
• （2）梯度酒精水化（无水酒精、95%酒精、 90%酒精、85%酒精、80%酒精） • 二、微波修复抗原
⑺ABC(1:100, Vector) 室温2h; • ⑻0.01 mol/L PBS 漂洗3次，每次5min; ⑼含0.03%DAB和0.006% H2O2的Tris 盐酸缓冲液(TB, pH7.6)室温10~15 min。
免疫组化ABC法
实验步骤
• （10）0.01 mol/L PBS 漂洗3次，每次5min;
免疫组化 ABC法
一 ABC法 实验原理
组织抗原
第一抗体 第二抗体 HRP 生物素 亲和素
原理：酶标记Biotin形成酶素化
Biotin 酶 素 化 Biotin ＋ Avidin--- ABC复合物 抗 原 --- 特 异 抗 体 --Biotin 标 记 二 抗 --Avidin ● Biotin ●