人白蛋白重组表达的最新研究进展-ppt

整合位点：酵母核糖体RNA 的基因rDNA 在染色体中具有 100～200 个重复,是提高外源基因拷贝数的最佳整合位点 之一。 宿主菌选择：根据利用甲醇的能力不同, 巴斯德毕赤酵母 菌分为Mut+ 、Muts 和Mut- 3种表型。蛋白酶缺失的宿主菌 可减少表达蛋白的酶解消化, 有利于外源蛋白的稳定。 信号肽修饰：信号肽结构的改变(如突变、修饰、融合等) 可能会提高分泌效率。有研究发现，改造了的信号肽大大 22 2011-04-01 提高了外源蛋白表达量。
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人重组白蛋白不同表达体系的对比
技术可行性 细菌 酵母 可行 可行 表达量 毫克级 克级。国外 有报道，达 到5g/L,7g/L 高 提取、纯化 难度高，后 修饰困难 难度小。外 分泌，可完 成信号肽切 除 容易 安全性 高
活性 低 高
动物 植物
技术不成熟， 实验室阶段 可行，在马 铃薯有成功 表达，不成 熟
基因剂量
表达载体单元插入到宿主菌表达系统时，可采用质粒直接转化到宿主 菌细胞中呈附加体型载体( Episomal vector) 存在,也可通过线型特异 位点整合到酵母菌的染色体上。当外源基因表达单元呈整合型 ( Integrative type) 存在于染色体上时,因随染色体的复制而复制,遗传
降解控制
改造P. pastoris 表达宿主菌株, 缺失基因组中主要蛋白水 解酶的基因, 使目的基因稳定。 在培养液中补加一些富含氨基酸的组分和酪蛋白水解物、 胃蛋白水解物, 或在培养基中加入YP (酵母提取物+ 蛋白 胨) , 提供给酵母细胞蛋白酶过量的底物, 以减少目的蛋白 的降解 加入蛋白酶抑制剂 毕赤酵母在非缓冲培养基中生长表达, 将pH 降到3 或更低, 使得许多中性pH 蛋白酶失活 共表达蛋白酶抑制物来抑制蛋白酶活性, 减少目的蛋白降 解 将目的蛋白连上一个过氧化物酶体靶向信号使其被分拣转 运入过氧化物酶体贮存起来, 免受蛋白酶降解, 还可减少对 宿主细胞的毒害作用 2011-04-01 23
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来源网址： http://www.taoguba.com.cn/Article/430719/1
外界传闻：华北制药：马上要公告获得人造白蛋白。 事实上有消息源确认重组人血白蛋白马上投产就等批文 可以理解为一旦批文下发，马上投产 市场价人造白蛋白10克500块 公司设计产能15吨 15吨产能，预计 2010 年底建成，2011 年初投产 新闻： 2011中国人血白蛋白制品360°产业论坛 时间： 2011-3-18 至 2011-3-19 地点：上海和颐酒店 主办单位： 世易传媒
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rHSA 表达体系的建立
随着基因重组技术所表达蛋白的复杂性越来越高， 酵母作为真核生物具有能对所表达的蛋白进行翻 译后修饰，易于大规模培养等优点逐渐取代大肠 杆菌生产外源蛋白。在HSA的重组研究过程中， 人们分别采用了酿酒酵母、汉逊醉母、裂殖酵母、 克鲁维氏酵母、毕赤酵母等作为宿主细胞，以及 转基因动物、转基因植物来分泌表达重组人血白 蛋白。
通过调整培养基的p H 值,在培养基中添加1 %酪氨酸蛋白水 解物等措施来抑制蛋白酶活性,使降解程度减至最低。此外选 用蛋白酶缺陷的受体菌是减弱蛋白酶作用的有效方法 诱导期间培养基中定期补充诱导剂,对于诱导表达外源蛋白十 分重要。如对于毕赤甲醇酵母诱导期间培养基中每天应补加 甲醇,以弥补甲醇的消耗和蒸发。 诱导时间也是影响外源蛋白表达量的重要因素, 诱导时间过短 表达量低, 诱导时间过长则外源蛋白降解增加
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影响酵母表达外源蛋白的因素
外源基因特性 主要涉及外源基因 mRNA 5′端非翻译区、A + T 组成和密码
子的使用频率
外源基因拷贝数和稳定性
酿酒酵母和一些其他的酵母有多拷贝的内源质粒是建成高拷 贝表达载体基础。克隆位点影响外源基因表达的高效稳定。 一般情况下,毕赤甲醇酵母中外源基因整合的拷贝数愈高,则蛋 白表达量愈大。
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极其稳定。
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毕赤酵母表达重组人血清白蛋白
rHSA 的发酵过程包括二个阶段, 以甘油为碳源积 累生物量的生长期和以甲醇为碳源的rHSA 诱导 表达期。 甲醇的流加速率控制在培养基中的浓度小于1 % , 一般诱导表达150～300h 左右。整个过程的pH 控制在610 左右, 溶氧控制在10 %以上。 在两段法的发酵条件优化方面, 发现将甘油和甲醇 混合流加可提高rHSA 产量, 也就是诱导开始时首 先流加甲醇, 在确保醇氧化酶被诱导后, 开始混合 流加。混合流加时严格控制甘油和甲醇的度比例 和流加速率, 使发酵液中甘油不积累, 同时甲醇浓 度不超过0.5 %。
安全 -
高 -
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酵母表达体系的建立
毕赤酵母由于分泌蛋白量高、表达稳定，且70年 代人们曾广泛使用毕赤酵母生产单细胞蛋白，已 基本掌握其生长规律及大规模高密度发酵技术， 采用甲醇诱导强启动子AOX，起始转录人血白蛋 白，将表达质粒整合到Pichia pastoris的基因组染 色体上，表达质粒不会因酵母传代而丢失，可稳 定表达目的产物，且表达量高，用甲醇诱导时， 表达率可占分泌总蛋白的80%以上。这非常有利 于产物的提取。
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提高表达的一些策略
启动子：最近在巴斯德毕赤酵母中克隆到的一个组成型三 磷酸甘油醛脱氢酶启动子PGAG ,在它的控制下β- LabZ 基 因表达率比甲醇诱导下PAOX1 驱动的产量更高,由于该组成 型启动子不需要甲醇诱导,发酵工艺更简单,同时其产量更 高,所以成为代替PAOX1最有潜力的启动子。
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国外研究进展
国外许多实验室和公司在重组白蛋白方面进行了大量研究， 如英国的DELTA公司，美国的GENETECH公司以及日本 的三菱公司等。日本在重组人血白蛋白方面的研究走在了 最前面。1994年日本的绿十字GREEN CROSS（三菱公 司的前身)公司被批准进人二期临床，现在日本三菱公司 已完成三期临床。该公司已经建厂进行大规模生产，一期 工程完毕可达12.5吨/年的生产能力，并计划逐步提高到 40吨/年，已预定商品名“Albrec”,所生产的产品纯度可达 99.999999%,英DELTA公司已经完成一期临床试验，美国 等正处于临床前研究阶段。
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酵母细胞表达系统中常用载体
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不同酵母表达体系比较
酿酒酵母 毕赤酵母 汉逊酵母
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rHSA 常用表达系统中的比较-1
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rHSA 在不同表达系统中的比较-2
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目前除英国 DETLA 公司采用酿酒酵母作为宿主 表达 rHSA 以外，其他公司和单位普遍采用毕赤 酵母作为 rHSA 的表达宿主。
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国内外研究进展
Lawn R .M. 等在1981年首次报道了重组人血白蛋白 (Recombinant Human Serum Albumin ,rHSA)cDNA序列 和首次采用色氨酸(Trp)启动子，色氨酸引导肽及来自质粒 pBR322的Tcr和Ampr基因构建了第一个表达重组人血白 蛋自的表达载体pHSAI并在大肠杆菌(E.coli)中得到了成功 表达。HSA在大肠杆菌中表达量为细胞总蛋白的7%，但 由于HSA含有大量的二硫键使得其在体外极难完成正确折 叠，未能得到有生物功能的蛋白;同时细菌细胞壁脂多糖 造成热反应也带来很多麻烦。
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
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来源网址： http://www.taoguba.com.cn/Article/430719/1
基因重组人血白蛋白与华北制药 王平 华北制药股份有限公司董事长 关于产品简介：重组人血白蛋白未来将成为重磅产品 同人血白蛋白相比，重组人血白蛋白不仅纯度更高，而且可以有 效地避免人血白蛋白携带病毒的风险，另外还可以解决血源供应的周 期性等问题。因此，重组人血白蛋白实现大规模量产在血液制品行业 将具有革命意义。 受益于国内血制品行业的高景气度，该产品的市场潜力巨大。人 血白蛋白市场供应缺口较大，并且这种局面不会在短时间改善。基因 重组人血白蛋白是人血白蛋白的替代产品。至今，在国际上掌握重组 白蛋白的厂商也只有三家，日本绿十字、英国 Delta 公司和美国的默 克。国内除华北制药外尚无单位能规模化生产重组白蛋白项目。华北 制药除培养基级白蛋白外还掌握了更高级别的白蛋白技术，白蛋白产 品纯化技术已经达到国际上先进水平。 2011-04-01
华东理工大学郭美锦，储炬等于2000年发表文章称该校生 物反应器工程国家重点实验室已经采用 Pichia pastoris 进 行了高密度高表达发酵研究,表达水平已达到5 克/ 升左右。
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来源网址： http://bar.stcn.com/redirect.php?tid=3180088&goto=lastpost 华北制药： 药用基因工程重组人血白蛋白研发及产业化项目 华北制药集团新药研究开发有限责任公司从1997年开始采 用毕赤酵母作为宿主菌分泌表达重组人血白蛋（rHSA ）。 经过多年的努力，通过与国内外有关单位协作，已建立了 从菌种构建至发酵、纯化的完整工艺。已得到稳定高效表 达人血白蛋白的基因工程生产菌株完成了中试研究，开发 了具有自主知识产权的纯化工艺路线。制定了重组人血白 蛋白的质量标准草案，中试规模制备的样品各项指标检定 合格。 本项目内容为按照现行CMP 要求开发规模生产艺．建 设药用重组白蛋白生产基地，年生产规模达到吨级。市场 分析，白蛋白总销售量为120-150吨左右。
主要内容
国内外进展 酵母表达体系的建立 rHSA在毕赤酵母的表达 影响酵母表达外源蛋白的因素 提高rHSA表达的一些策略 rHSA在汉逊酵母中的表达与纯化 新型集成干扰素-人血清白蛋白融合蛋白在毕赤酵母中的 分泌表达和纯化 rHSA 结构分析 rHSA 的应用展望
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毕赤酵母表达重组人血清白蛋白
表达系统构建 信号序列选择
①很多异源蛋白分泌表达时已具有成熟蛋白正确的 N 端氨基酸序列, 且大部分分泌表达的异源蛋白是以它们自己同源信号序列引导的,分泌 表达rHSA 亦可以采用其自身的信号肽序列,即 HSA 引导肽序列。 ②rHSA 的分泌也可用酵母宿主菌本身的同源信号序列，如来自 Pichia pastoris 的 PHO5 引导序列和来自 S . cerevisiae 的α-杂交因 子(AMF)引导序列。
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国内研究进展
近几年来，我国也掀起了重组HSA的研究热潮，华北制药 集团、中科院上海生化所、华东理工大学、中山医科大学、 中科院微生物所、过程工程研究所，以及安徽中科大亚杰 科技股份有限公司等单位己经开始利用基因重组技术生产 白蛋白的研究;目前我国在这方面的研究工作已经取得一 定进展。
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影响酵母表达外源蛋白的因素
表达条件的优化
表达条件的优化主要包括通气量、培养基、摇菌密度、蛋白 酶、诱导剂的含量等。 充足的通气量对于诱导阶段外源蛋白的表达是极其重要的。
有报道认为, 如果用发酵罐进行培养, 外源蛋白的表达水平要比普通摇瓶发酵高出 10～ 100 倍。
人血清白蛋白的酵母重组表 达研究进展
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人血清白蛋白供需不平衡
监管严格 采血站数量下降 血液传染病病毒泛滥 不再审批新的生产企业 进口受到严格限制 需求量巨大 2011年02月12日有文章称《血液制品“告 荒”》
国内血液制品的严重短缺。这类产品，除了人血白蛋白， 其他的血液制品如乙肝免疫球蛋白、静脉丙种球蛋白等都 处于严重短缺的状态。 来源网址：凤凰网财经频道 2011-04-01 2 http://finance.ifeng.com/roll/20110212/3389405.shtml