重组融合人血清白蛋白-人白介素-2+C125A突变体在毕赤酵母中的表达

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人血清白蛋白-C肽融合蛋白在毕赤酵母中的分泌表达

人血清白蛋白-C肽融合蛋白在毕赤酵母中的分泌表达
人血清白蛋白-C肽融合蛋白在毕赤酵母中的分泌表达
目的构建重组表达人血清白蛋白(HSA)-C肽(CP)融合蛋白的毕赤酵母表达菌株.方法根据表达系统的.密码子偏好性优化CP基因,酶切连接pBlue-HSA质粒(HSA1 800bp)和CP(100bp)基因,将HSA-CP融合基因双酶切后插入分泌表达栽体pPIC9K中,重组质粒pPIC9K-HSA-CP经SalⅠ线性化后,电击转化毕赤酵母GS115,表型筛选Mut+转化子.PCR鉴定后,用甲醇诱导摇瓶分泌表达.结果融合基因约为1 900bp,序列测定正确.SDS-PAGE分析表明表达融合蛋白的相对分子量约为70kD,摇瓶培养表达量为140mg/L,Western blot鉴定显示表达的融合蛋白为HSA和CP的杂合分子.结论实现了HSA-CP融合蛋白在毕赤酵母中的分泌表达,细胞活性研究显示HSA-CP融合蛋白对人胚肾293细胞的生长具有一定的促进作用.
作者：周利苹张莲芬雷楗勇张文婷蔡燕飞金坚 Zhou Liping Zhang Lianfen Lei Jianyong Zhang Wenting Cai Yanfei Jin Jian 作者单位：江南大学医药学院分子药理研究室,江南大学工业生物技术教育部重点实验室,无锡,214122 刊名：生物技术通报 PKU 英文刊名：BIOTECHNOLOGY BULLETIN 年，卷(期)：2008 ""(3) 分类号：Q94 关键词： C肽人血清白蛋白融合蛋白毕赤酵母。

人血清白蛋白-白介素-2融合蛋白在CHO细胞中的表达

人血清白蛋白-白介素-2融合蛋白在CHO细胞中的表达卢慧惠;彭林;段作营;蔡燕飞;金坚;李华钟【期刊名称】《食品与生物技术学报》【年(卷),期】2017(036)005【摘要】白细胞介素-2在人体免疫应答中具有重要作用,常用于治疗肿瘤、肝炎和免疫缺陷性疾病等多种疾病,但因其体内半衰期短而限制了其临床应用.文中构建了合有融合蛋白基因HSA-IL-2的pMH3质粒,并通过电转染的方法转入中国仓鼠卵巢细胞(Chinese hamster ovarycell,CHO细胞)中,利用pMH3质粒所携带的neo 基因进行筛选,经96孔板培养并筛选得到稳定表达目的蛋白质的重组细胞,融合蛋白HSA-IL-2表达量达到2.26 mg/L.利用反转录PCR和Western blot对重组细胞鉴定后发现,融合蛋白编码基因整合入重组CHO细胞基因组中,而且融合蛋白同时具有HSA和IL-2双重免疫原性.利用对IL-2具有依赖性的CTLL-2细胞进行活性分析后发现,筛选得到的表达细胞分泌得到的融合蛋白具有较高的生物活性,表明成功构建具有表达IL-2生物活性能力的CHO细胞.【总页数】5页(P456-460)【作者】卢慧惠;彭林;段作营;蔡燕飞;金坚;李华钟【作者单位】江南大学工业生物技术教育部重点实验室,江苏无锡214122;江南大学工业生物技术教育部重点实验室,江苏无锡214122;江南大学工业生物技术教育部重点实验室,江苏无锡214122;江南大学药学院,江苏无锡214122;江南大学药学院,江苏无锡214122;江南大学工业生物技术教育部重点实验室,江苏无锡214122【正文语种】中文【中图分类】Q786【相关文献】1.重组毕赤酵母表达人血清白蛋白-人白介素2融合蛋白过程的代谢特性 [J], 王舒;郑志永;詹晓北;史仲平;高敏杰;刘立明;金坚;李华钟2.牛pAcGFP-FADD融合蛋白真核表达载体构建及在CHO-K1细胞中的表达 [J], 杨润军;许尚忠;张路培;李俊雅;高雪3.甲状旁腺激素-人血清白蛋白融合蛋白在CHO细胞中的表达 [J], 张焕;徐栋生;蔡燕飞;陈蕴;金坚4.甲状旁腺激素-人血清白蛋白融合蛋白在CHO细胞中的表达 [J], 张焕;徐栋生;蔡燕飞;陈蕴;金坚;5.人白介素-2／人血清白蛋白融合蛋白在毕赤酵母中的表达 [J], 郭泽峰;段作营;张莲芬;金坚;李华钟因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

IL1Ra-HSA基因的克隆及其在毕赤酵母中的表达的开题报告

IL1Ra-HSA基因的克隆及其在毕赤酵母中的表达的
开题报告
一、研究背景及意义
癌症、自炎症和感染等都会引发炎症反应，而炎症反应的过度也会导致一系列的疾病。

因此，控制炎症反应就成为相关疾病治疗的关键。

白细胞介素1受体拮抗剂（IL-1Ra）作为人体的天然抗炎因子，具有多种抗炎和抗癌作用，而且没有明显的副作用，被广泛应用于临床治疗。

因此，对其进行研究有利于新型治疗药物的开发。

在本研究中，旨在将IL-1Ra与人血清白蛋白（HSA）融合，并在毕赤酵母中高效表达，以便更好地应用于各种疾病的治疗。

二、研究内容及方法
1.基因克隆：采用PCR方法以人源IL-1Ra和HSA为模板，通过引物设计扩增出IL1Ra-HSA融合基因，并进行双酶切后，将其连接到表达载体pPICZαA中。

2.毕赤酵母转化：将连接成功的重组质粒转化到毕赤酵母中，通过蓝白斑筛选和PCR鉴定，筛选出高效表达的毕赤酵母菌株。

3.表达条件优化：通过对毕赤酵母菌株的不同发酵条件的比较，寻找最适合的表达条件，从而提高表达效率。

4.纯化和鉴定：采用亲和层析等方法对表达的IL1Ra-HSA进行纯化和鉴定，测定其生物活性和纯度。

三、预期成果及意义
1.成功将IL-1Ra与HSA融合，并通过PCR克隆到毕赤酵母中。

2.筛选出高效表达的毕赤酵母菌株，并通过表达条件优化提高其表达效率。

3.成功对表达的IL1Ra-HSA进行纯化和鉴定，并测定其生物活性和纯度。

4.为进一步研究IL-1Ra在临床应用中的新型治疗策略提供了基础研究支持。

重组人uPA_(17)-KPI在毕赤酵母中的表达及鉴定

虫国实验诊断学
２１年ｌ月００１
第ｌ卷４
第１期１
—
１８６５一
文章编号：０７２７２１）１６５— ４１０ —４８（００１ —１８０
重组人ｕＡ１ＫＩ毕赤酵母中的表达及鉴定Ｐ７Ｐ在一
赵磊，炜群颜
ａｄＤＮｅｕｎｉｇｐｏｉｇｗｏｆｅａＰ７ＫＩｐＩＺＣｗｓｓｃｅｓｌｏｓｒｃｄＳＳＰＧＥｓｏｄｔａｅｒｌｔｅｎＡｓｑｅｃｎｒｖｎ，ｅｃｎｒｄｔｔＡｌＰ — ＰＣａａｕｃｓｆｌｃｎｔｔ．Ｄ－Ａｈｗｅｔｅｉｉｍｈｕ一ｕｙｕｅｈｔｈａｖｍｏｅｕａｓｆｅｅｔｔｎｐｏｕｔａｂｕ０Ａｔｒｉｄｃｉｎｗｔｔａｏｏ２ｔｅｙｅｄｏＰ７ＫＩｏｄｂ０ｌｃｌｒｍａｓｏｒｎａｉｒｄｃｓａｏｔ８０．ｆｕｔｉｍｅｎｌｒ１０ｈ，ｉｌｆｕＡ１Ｐｕｅ５ｆｍｏｗ８ｅｎｏｈｈｆｈ一ｃｌ
利用已构建的ＫＩＰＣａＰ— ＩＺＣ毕ｐ
赤酵母表达载体，人工合成ｕＡ７利用基达载体。电转化毕赤酵母菌Ｘ３，Ｃｐ－３ＰＲ酶切鉴定和ＤＡ测序证实，Ｎ成功
构建ｕＡ－Ｐ－ＰＣＰ ” ＫＩＩ７ｐ￣Ｃ表达载体。ＳＳＰＧＤ－ＡＥ分析在相对分子质量约８８０处出现目的条带，瓶水平诱导表达１０ｈ０摇２本研究在毕赤酵母中成功表达ｕＡＰ

人白介素2-红色荧光蛋白在毕赤酵母中的重组表达及其体外缓释促进T

专利名称：人白介素2-红色荧光蛋白在毕赤酵母中的重组表达及其体外缓释促进T细胞增殖的应用
专利类型：发明专利
发明人：刘冠楠,章文明,黄雨欣,陆然,刘颖,华芷钰,倪怡静,顾春阳,邓哲文,邓涵之,迟波
申请号：CN202010217384.8
申请日：20200325
公开号：CN111334546A
公开日：
20200626
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明公开了人白介素2‑红色荧光蛋白在毕赤酵母中的重组表达及其体外缓释促进T细胞增殖的应用，其包括如下步骤：将重组人白介素2‑红色荧光蛋白的毕赤酵母表达菌株的种子液接种到发酵培养基中发酵，当发酵液的OD值趋于稳定时，停止发酵，将发酵液纯化处理后，即得到人白介素2‑红色荧光蛋白。

与现有技术相比，本发明中以pGAP‑KanR为组成型表达质粒，采用了以甘油为碳源的发酵培养基，实现了连续高密发酵，操作简便，成本更低，解决了现有技术中发酵过程中需要额外添加物质进行诱导的缺陷。

申请人：南京工业大学
地址：211816 江苏省南京市浦口区浦珠南路30号
国籍：CN
代理机构：江苏圣典律师事务所
代理人：胡建华
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人核迁移蛋白C在毕赤酵母中的融合表达

ＫＭ７１ｂｌｃｒｃｓｏｋａｄｏｔｉｅｒｎｆ肿ａｔｂｄｐｉｇＺｏｉｃｅｎＲｅｕｔ：ｈｒｓｈｇｅｘｒｓｉｎｏｕｐｓｒｔｉｙｙｅｅｔｈｃｎｂａｄｔａｓｉｎｌ．０ｎｓｙａｏｔｅｃｎｓｒｅ．ｓｌＴｅｅｗａｉｈｒｅｐｅｓｆｐｒｏｅｐｏｅｎｂｎｓｏｏｔｚｎｉｄｃｄｘｒｓｉｎｏｄｔｎ．ｎｌｓｏ：ｇｅｅｐｅｓｏｏｅｓｌｄｇａａｌｐｔｉｈｐｉｉｇｎｕｅｅｐｅｓｏｃｎｉｏｓＣｏｃｕｉｎＨｉｈｒｘｒｓｉｎｆａｉｍｉｉｙｅｒｄｂｅｒｅｎＮＵＤＣｏｃｎｂｅｈｎｅａｅｎａｃｄｓｂｔｎｉｌｎＰｃｉａｔｒｕｓａｔｌｉｉｈａｐｏｉＫＭ７ｂｐｉｚｇｉｄｃｄｅｐｅｓｏｏｄｔｎ．ａｙｓｓｙｏｔ１ｍｉｎｕｅｘｒｓｉｎｃｎｉｏｓｎｉｉ
Ｍｅｈｄ：ＲｅｏｉａｔｅｐｅｓｏｌｍｉＰＣｃＡ — ＮＵＤＣ－ｉｗａｅｔｃｅｙｓｎｌｎｙｘＸ，ｗｓｓｉｅｉｈａｐｓｏｓｔｏｓｃｍｂｎｎｘｒｓｉｎｐａｄｐＩＺｔｈｓｈｓｓｒｓｉｔｄｂｉｇｅｅｚｍｅＢｔＩｒａｈｆｄＰｃｉａｔｆｔｉ
甘肃医药２１年第２００９卷第５期
ＧｎｕＭｅｉａＪｕｌ，ｃ２１，ｏ．，ｏａｓｄｃｌｏｍａＯｔ０ Hale Waihona Puke Ｖ１９Ｎ．２５・

人血清白蛋白和人干扰素α2b的融合蛋白在毕赤酵母中的表达

人血清白蛋白和人干扰素α2b的融合蛋白在毕赤酵母中的表达唱韶红;巩新;杨志愉;王同映;马国昌;马清钧;吴军【期刊名称】《生物工程学报》【年(卷),期】2006(22)2【摘要】为了延长IFNα2b在血浆中的半衰期,构建了编码HSA和hIFNαb的融合基因并在毕赤酵母中获得高效表达,工程菌经5L发酵罐培养后获得的含融合蛋白的培养液经超滤浓缩、蓝色葡聚糖凝胶层析、疏水柱层析以及阴离子柱层析,融合蛋白的纯度达到95%以上.该融合蛋白能与干扰素抗体和人血清白蛋白抗体结合,并表现出与重组干扰素α2b相似的抗病毒活性.以猕猴为动物模型,分别从静脉和皮下单剂量给药,给药浓度为90μg/kg时,在336h后血浆中仍可检测到融合蛋白.其静脉注射的血浆半衰期为101h,皮下注射的半衰期为68.2h.皮下注射的生物利用度为67.9%.IFNα2b与HSA融合后,明显的延长了血浆半衰期,显现了其良好的临床应用前景.【总页数】7页(P173-179)【作者】唱韶红;巩新;杨志愉;王同映;马国昌;马清钧;吴军【作者单位】军事医学科学院生物工程研究所,北京,100071;军事医学科学院生物工程研究所,北京,100071;杭州九源基因公司,杭州,310000;杭州九源基因公司,杭州,310000;杭州九源基因公司,杭州,310000;军事医学科学院生物工程研究所,北京,100071;军事医学科学院生物工程研究所,北京,100071【正文语种】中文【中图分类】Q786【相关文献】1.人血清白蛋白和干扰素α2b融合蛋白在毕赤酵母中表达及质量控制 [J], 钱凯;雷楗勇;关波;陈蕴;饶志明;金坚2.人血清白蛋白-睫状神经营养因子突变体融合蛋白基因在毕赤酵母中的表达及表达产物的纯化和活性鉴定 [J], 赵洪亮;薛冲;熊向华;张伟;杨秉芬;刘志敏3.重组人血清白蛋白-干扰素α2b融合蛋白在PichiaPink系统中的表达 [J], 任敏;赵洪亮;薛冲;沈非;杜济良;陈冬生;刘志敏4.人胰高血糖素样肽-1与人血清白蛋白融合蛋白在毕赤酵母中的表达 [J], 龙娟;薛冲;赵洪亮;杨晓红;刘志敏5.重组人血清白蛋白与干扰素α-2b融合蛋白中聚乙二醇1500残余量测定方法研究 [J], 张娜; 杜莹莹; 李月; 常早荣; 薛冲; 刘志敏; 任飞因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

重组人血清白蛋白在毕赤酵母表达中的降解控制

第31卷第4期2004年北京化工大学学报JOURNAL OF BEI J IN G UN IV ERSIT Y OF CHEMICAL TECHNOLO GYVol.31,No.42004重组人血清白蛋白在毕赤酵母表达中的降解控制孙战胜　陈劲春3(北京化工大学生命科学与技术学院,北京　100029)摘　要:在利用转基因毕赤酵母发酵表达重组人血清白蛋白时,遇到了较为严重的蛋白降解;为了抑制蛋白的降解,分别研究了温度、p H 值和氮源的加入对降解的影响。

结果表明,p H 值和氮源的加入对白蛋白的降解控制有显著的正面影响,而温度的变化对降解的影响不大。

当控制p H 为710,添加酵母提取物和蛋白胨体积分数分别为015%和1%时,白蛋白的降解得到了有效的控制,可得到质量分数为58%的完整白蛋白。

关键词:毕赤酵母;重组人血清白蛋白;蛋白降解;温度;氮源中图分类号:Q93919收稿日期:2003211220第一作者:男,1974年生,硕士生3通讯联系人E 2mail :sunzs0927@引　言毕赤酵母是一种能以甲醇为唯一碳源的真核生物,如今已发展成为高效的外源基因表达系统。

其具有表达量高、可以高密度培养、培养成本低、产物可以分泌到胞外、糖基化程度适中等优点。

迄今为止已成功的表达了100多种外源蛋白[1]。

国内外目前均有用毕赤酵母表达重组人血清白蛋白(rHSA )的报道,表达中遇到的主要问题之一是rHSA 出现了不同程度的降解[223]。

关于毕赤酵母对所表达目标蛋白的降解,有的研究者认为,其中一个重要原因是氮源的缺乏[2],本文考察了不同种氮源和氮源浓度对控制蛋白降解的作用。

另外,毕赤酵母在表达其它一些蛋白时,也同样存在蛋白降解的问题,目前报道控制降解的主要措施有改变生长期的p H 值[4]、低温诱导[5]等。

考虑到p H 值和温度是影响酵母蛋白酶活性的重要参数[6],并参考毕赤酵母的适宜生长温度和p H 值(温度20～31℃,p H310～710),本文对温度和p H 值对降解的影响进行了实验探索。

共表达蛋白质折叠辅助因子对毕赤酵母分泌表达IFNβ-HSA融合蛋白质的影响

共表达蛋白质折叠辅助因子对毕赤酵母分泌表达IFNβ-HSA融合蛋白质的影响陈凤祥;关波;陈蕴;段作营;金坚;李华钟【期刊名称】《食品与生物技术学报》【年(卷),期】2014(033)012【摘要】探索共表达蛋白质折叠辅助因子Ero1、PDI和BiP对毕赤酵母GS115分泌表达融合蛋白质IFNβ-HSA的影响.将构建的蛋白质折叠辅助因子表达载体pGAP-Ero1、pGAP-PDI、pGAP-BiP和空载对照线性化后,电击转化重组毕赤酵母GS115/IFNβ-HSA细胞,用含有400 μg/mLzeocin的YPD平板筛选阳性转化子,并采用PCR和Western blot法进一步鉴定.阳性转化子进行摇瓶发酵后,采用SDS-PAGE及Western blot法分析共表达Ero1、PDI和BiP对IFNβ-HSA表达水平的影响.结果表明,Ero1、PDI和BiP成功地在胞内过量表达,且不影响宿主细胞的正常生长;共表达Ero1和PDI分别使IFNβ-HSA的表达量提高了80％和90％,而共表达BiP则对IFNβ-HSA的表达水平无明显影响.【总页数】5页(P1246-1250)【作者】陈凤祥;关波;陈蕴;段作营;金坚;李华钟【作者单位】江南大学工业生物技术教育部重点实验室,江苏无锡214122;江南大学工业生物技术教育部重点实验室,江苏无锡214122;江南大学药学院,江苏无锡214122;江南大学工业生物技术教育部重点实验室,江苏无锡214122;江南大学药学院,江苏无锡214122;江南大学工业生物技术教育部重点实验室,江苏无锡214122【正文语种】中文【中图分类】Q786【相关文献】1.共表达HAC1基因对重组毕赤酵母分泌表达葡萄糖氧化酶的影响 [J], 顾磊;张娟;堵国成;陈坚2.人C-型利钠肽-血清白蛋白融合蛋白质的构建及在毕赤酵母中的分泌表达 [J], 李洁;张莲芬;孙钧铭;雷楗勇;陈伟;金坚3.毕赤酵母中表达HSA/IL1ra融合蛋白的产物不均一现象的研究 [J], 戴寿沣;沈其;陈静;陈枢青4.α-1,6-甘露糖转移酶基因敲除的毕赤酵母菌株构建及其用于融合蛋白HSA/GM-CSF表达的研究 [J], 王越;巩新;唱韶红;刘波;宋淼;黄海华;吴军5.共表达分子伴侣提高漆酶在毕赤酵母中的分泌 [J], 王晨蕾; 刘松; 堵国成; 陈坚因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

重组融合人血清白蛋白-人白介素-2 C125A突变体在毕赤酵母中的表达

第２９卷第４期２１００年７月
食品与生物技术学报
ＪｕｎｌｆｏｄＳｉｎｅａｄＢｉｔｃｎｌｇｏｒａｏｃｅｃｎｏｅｈｏ０ｙｏＦ
Ｖ０１２ＮＯ．．９４
Ｊ１２１ｕ．００
ｃｓｒｃｈｅｅｘｒｓｉｎｐｌｓｉＰＨＩｂｅｔｉｔｖｉｓｉｎｄｌｇｔｏｎＲｅｏｂｉｎａｔｏｎｔｕｔｔｐｅｓｏａｍｄｐｍｙｒｓｒｃｉｅｄｇｅｔｏｎａｉａｉ．ｃｍｎａｔｙｅｓ
盐、冻干制备的粗蛋白的Ｉ－Ｌ２生物学活性为１５ｘ１。Ｕ／。结论：Ｐ．ｐｓｒｓ１５中成．１０Ｉｍｇ在ａｔｉＧＳ１ｏ
功表达了具有人白介素一物学活性的ＨｓＩ２融合蛋白。２生Ａ—Ｌｍ
关键词：突变型入白介素一；２人血清白蛋白；赤酵母；毕融合蛋白
文章编号：６３１８（０００ — ５５０１７ —６９２１）４０９ — ７
重组融合人血清白蛋白一白介素一１突变体人２Ｃ２Ａ５在毕赤酵母中的表达
金光泽段作营张莲芬金坚李华钟 ¨ ，，，，
Ｃ２Ａ突变的Ｉ一１５Ｌ２编码基因Ｉ一ｍ，Ｌ２通过酶切连接方法将其与人血清白蛋白（Ａ）编码基因ＨＳ的连接为融合蛋白ＨＳＩ２的编码基因。克隆到表达质粒ｐＩ９中，击转化Ｐ．ｐｓｏｉＡ—ＬｍＰＣＫ电ａｔｒｓ

重组人纤维蛋白原基因在毕赤酵母中的高效表达

重组人纤维蛋白原基因在毕赤酵母中的高效表达郝荣华;张晓元;刘飞;陈勉;王凤山;朱希强;凌沛学【摘要】Objective To construct a eukaryotic expression vector in Pichia pastoris containing human fibrinogen gene, in order to achieve high level secretory expression in extracellular.Methods Expressionplasmid,pGAPZαA-FGB-FGG-FGA-AOX1,was constructed by inserting the synthesized sequence encoding human fibrinogen(FGA, FGB,FGG) andthen introduced into Pichia pastoris SMD1168H byelectroporation.Transformants were availably screened by Zeocin resistance,the expression of recombinant protein was identified by SDS-PAGE and Western blot analysis, the protein yield was tested by ELISA assay.After ultrafiltration and purification, the biological activity of protein was detected.Results The crude yield of human fibrinogen in Pichia pastoris supernatant reached 15 mg/L in flask and the biological aggregation activity was determined.Conclusion The human fibrinogen gene was obtained and successfully expressed in Pichia pastoris and the active products were secreted into the medium.%目的：构建含有人纤维蛋白原基因的毕赤酵母表达系统，实现胞外高效分泌表达。

新型集成干扰素-人血清白蛋白融合蛋白在毕赤酵母中的分泌表达和纯化

１］疫功能的作用［。ＩＦＮ分子具有多种亚型，其中ＩＦＮ α
１材料与方法
１．１材料
＋酵母菌种ｐａｓｔｏｒｉｓＧＳ１１５（ｈｉｓ４Ｍｕｔ）和表达质粒
是第一个用于临床的基因重组细胞因子，已经被美国ＦＤＡ批准应用于病毒性肝炎、恶性肿瘤等多种疾病的治疗。但是干扰素分子量大约１９ｋＤａ，易被肾小球滤过，血浆半衰期短而治疗周期长，需要频繁注射给药，患者依从性较低。利用基因工程手段研制长效蛋白药物越来越受到人们的关注，方法之一是人血清白蛋白（ＨＳＡ）融合技术。ＨＳＡ是人体血液中天然的物质输送载体，血清中含量最高，其相对分子量约为６５ｋＤａ，是由５８５个氨基酸组成的单链球型蛋白质，无酶学及免疫学活性，体内半衰期长达１９天，是理想的改善药物半衰期的生物
２］载体［。
ｐＰＩＣ３．５购自Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司；ＮＦＩＮＨＳＡ基因由上海生工合成；ＢａｍＨＩ、ＥｃｏＲＩ、ＰｙｒｏｂｅｓｔＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅ、Ｔ４ＤＮＡ连接酶，均购自ＴａＫａＲａ公司。ＤＥＡＥＳｅｐｈａｒｏｓｅＦＦ、ＣＭＳｅｐｈａｒｏｓｅＦＦ购自ＡｍｅｒｓｈａｍＰｈａｒｍａｃｉａ公司。ＳＡ单克隆抗体购自Ｓｉｇｍａ。人羊膜细胞小鼠抗人Ｈ（ＷＩＳＨ）、水泡性口炎病毒（ＶＳＶ）均为北京三元基因工程有限公司保存。１．２方法１．２．１表达载体的构建将全基因合成的ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＫＳ（＋）ＨＳＡＮＩＦＮ质粒以ＢａｍＨＩ、ＥｃｏＲＩ双酶切，酶切产物回收后与毕赤酵母表达载体ｐＰＩＣ３．５连接，构建出ｐＰＩＣ３．５ＨＳＡＮＩＦＮ重组质粒。１．２．２毕赤酵母ＧＳ１１５的电击转化及筛选将２～４ｇＳａｌＩ线性化处理的重组质粒ｐＰＩＣ３．５ＨＳＡＮＩＦＮ电 μ 击转化感受态毕赤酵母ＧＳ１１５。电击结束后立即加入１ｍｌ１ｍｏｌ／Ｌ山梨醇，混匀后取２００ｌ涂布于ＭＤ平板 μ

重组人血清白蛋白在巴斯德毕赤酵母中的表达

重组人血清白蛋白在巴斯德毕赤酵母中的表达摘要人血清白蛋白是一种在医学上应用广泛，需求量大的蛋白质药物。

而目前血浆提取生产的方式难以满足市场的要求，用基因工程方法生产人血清白蛋白无疑具有巨大的商业价值。

由于巴斯德毕赤酵母表达系统自身的许多优点，使得其在表达外源蛋白中具有十分大的优势。

本文的工作是用巴斯德毕赤酵母（Pichia Pastoris）构建并筛选分泌重组人血清白蛋白(rHSA)基因工程高产菌株，并对其发酵纯化条件进行初步研究。

在构建高产人血清白蛋白的基因工程菌时，采用了分泌型表达质粒pPIC9K构建成质粒pPIC9K-hsa。

构建的质粒经线性化后电转化整合进入毕赤酵母GS115染色体AOX1基因中，通过MD/MM平板筛选出his+Mut s型菌株。

在此基础上，用G418平板筛选出高拷贝表达子。

BMGY/BMMY摇瓶培养对不同的拷贝子进行筛选，发现随着拷贝子的增加表达量增加。

其中菌株GS115-rHSA-8表达量最高。

免疫印迹检测所表达的rHSA具有免疫原性。

采用工业基础盐培养基，用摇瓶对发酵条件进行了实验研究。

结果表明，组氨酸的加入量为0.15g/L时，蛋白表达量增加57.1%；加入0.10%体积比油酸时，蛋白量可增加43.4%；甲醇浓度控制在0.5％体积比左右时可以获得高产量，甲醇的加量超过1%体积比时，会对蛋白的分泌表达产生抑制，在2%时已经比较明显；甲醇诱导时添加甘油时可以提高产量，但当甘油添加量达到0.2%体积比时甘油已产生抑制表达作用；诱导表达时硫酸铵浓度为7g/L时蛋白浓度最高，高于9g/L时已开始出现抑制表达作用；改变培养时发酵液的pH为7.0，诱导表达时添加 1.5%的YP(Yeast extract,5g/L; Peptone, 10g/L)均可以有效的控制rHSA的降解，而温度对蛋白的降解没有显著性影响。

另外，添加100μm的PMSF也对降解有较好的控制作用，但因为毒性原因其安全性值得评价。

人血清白蛋白与PTH(1—34)融合蛋白在毕赤酵母中的分泌表达及鉴定

ＭＤａｅＷｉｈＡＯＸｏｐｌｔ．ｔｐｒｍｏｔｒａｄＣＭＦｉｎａｅｅｃｓｌａｎｆｓｏｒｔｉｓｅｒｓｅｅｎｔ－ｓｇｌｓｑｕｎｅｅｄｉｇ，ｕｉｎｐｏｅｎｗａｘｐｅｓｄ
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人血清白蛋白与ＰＨ（—４融合蛋白在Ｔ１３）毕赤酵母中的分泌表达及鉴定
陈静，红颖，孙杨颖，学芬，王陈枢青
（江大学药学院生化药学研究室，浙浙江杭州３０５）１０８
化酶产生ｃＡＭＰ，活性低于Ｐ但ＴＨ（— ４。结论：毕赤酵母中成功表达了具有生物学活性的人血１３）在
清白蛋白与ＰＴＨ（— ４融合蛋白。１３）
［键词］毕赤酵母；甲状旁腺激素肽（ —４；血清白蛋白；粒；重组，传；人甲状旁腺激素关１３）质遗
（—４；融合蛋白；泌表达１３）分
［中图分类号］Ｑ６７８
［文献标识码］Ａ
［文章编号］１０—２２２０）２０２ —８０８９９（０８０—１６０
Ｃｏｔｕｔｏｎｓｒｃｉｎ，ｅｐｒｓｉｎｎｄｈｒｃｅｉａｉｎｆｅｏｂｎａｆｓｏｘｅｓｏａｃａａｔｒｚｔｏｏｒｃｍｉｎｔｕｉｎ

抗菌肽和人酸性成纤维细胞生长因子融合蛋白在毕赤酵母中的表达及其活性鉴定

抗菌肽和人酸性成纤维细胞生长因子融合蛋白在毕赤酵母中的表达及其活性鉴定苏志坚;吴晓萍;郑青;黄亚东;庞实锋;冯雅;李校堃【期刊名称】《中国药科大学学报》【年(卷),期】2005(36)1【摘要】目的 :构建和表达一种抗菌肽和人酸性成纤维细胞生长因子的融合蛋白 ,在创伤皮肤表面应用时能裂解成有功能的抗菌肽和人酸性成纤维细胞生长因子 ,预防伤口感染和促进皮肤修复。

方法 :利用PCR技术分别扩增出带有凝血酶切割位点的天蚕素杂合肽基因和人酸性成纤维细胞生长因子基因。

再将两者作为模板 ,用PCR方法扩增出编码融合蛋白的DNA。

将该DNA片段插入到载体pPICZαA中 ,并利用电转法将质粒转入毕赤酵母smd116 8中 ,Zeocin抗性筛选重组转化子。

甲醇诱导 96h ,SDS PAGE电泳检测融合蛋白的表达 ,并用Western blot杂交检测融合蛋白的免疫原性。

利用肝素亲和层析纯化融合蛋白 ,同时检测融合蛋白的抑菌和促3T3Bal/b细胞分裂活性。

结果 :筛选出能表达相对分子质量约为 19kD融合蛋白的重组转化株 ,SDS PAGE电泳检测显示甲醇诱导 96h后 ,融合蛋白表达量达到最高 ,且能与人酸性成纤维细胞生长因子抗体产生免疫反应。

融合蛋白没有抑菌活性 ,而裂解产物则具有抑菌活性。

此外 ,融合蛋白的促细胞分裂活性与野生型人酸性成纤维细胞生长因子相比没有明显的降低。

结论 :获得含凝血酶切割位点的抗菌肽和人酸性成纤维细胞生长因子的融合蛋白 ,并在毕赤酵母中实现了表达。

融合蛋白的裂解产物具有抑菌活性。

【总页数】6页(P63-68)【关键词】抗菌肽;人酸性成纤维细胞生长因子;融合蛋白;毕赤酵母;构建;表达【作者】苏志坚;吴晓萍;郑青;黄亚东;庞实锋;冯雅;李校堃【作者单位】暨南大学药学院;暨南大学医药生物技术研究开发中心【正文语种】中文【中图分类】Q503【相关文献】1.人血清白蛋白-睫状神经营养因子突变体融合蛋白基因在毕赤酵母中的表达及表达产物的纯化和活性鉴定 [J], 赵洪亮;薛冲;熊向华;张伟;杨秉芬;刘志敏2.TPO模拟肽与人IgG1Fc融合蛋白在毕赤酵母中的表达及活性鉴定 [J], 叶祥忠;郭强;李朝;刘凤云;程度胜3.人纤溶蛋白酶原K5在毕赤酵母中的表达及其生物活性鉴定 [J], 沈利;宋大新;高卜渝;吕红;李育阳4.抗菌肽牛乳铁蛋白肽衍生肽在毕赤酵母中的表达及活性鉴定 [J], 李忠清;王亮5.p75NTR-Fc融合蛋白在毕赤酵母中的表达、鉴定和活性分析 [J], 周素芳;王欣;陈虹;黄秉仁因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

重组人血清白蛋白-干扰素α2b融合蛋白在PichiaPink系统中的表达

重组人血清白蛋白-干扰素α2b融合蛋白在PichiaPink系统中的表达任敏;赵洪亮;薛冲;沈非;杜济良;陈冬生;刘志敏【期刊名称】《生物技术通讯》【年(卷),期】2011(022)006【摘要】Objective: The aim of this experiment was to compare the differences between the PichiaPink strain and Pichia pastoris GS115 strain, and further explore the potential advantages of the PichiaPink system. Methods: The recombinant expression vectors contained the fusion gene coding human serum albumin and interferon α2b fusion protein (HAS-IFN-α2b) were constructed, and were transformed them into the P.past oris GS115 and the PichiaPink strain respectively. The fusion protein of HAS-IFN-α2b were expressed by methanol induction, and the expression level was evaluated. The SDS-PAGE analysis was used to detect the degradation of HAS-IFN-α2b in the P.pastoris GS115 and the PichiaPink strain. Results: Essentially all transformants in the PichiaPink system showed to express the objective protein of HAS-IFN-a2b, but only 60% transformants in the GS115 strain displayed to express the target protein. In the same kind strains of Pink, the expression levels of HAS-IFN-α2b were respectively compared, which discovered the strain that have integrated with the pPink-HC vector is higher expression than the strain that have integrated with the pPink-LC vector. The PichiaPink strains which had knockoutedthree proteases genes expressed the fusion protein of HAS-IFN-α2b to exhibit a little degradation in YPD and BMMY medium, but HAS-IFN-α2b degradation phenomenon showed very serious in BSM medium. Conclusion: The results have indicated to have an important value for high-level expression and large-scale production of secreted recombinant proteins in PichiaPink system.%目的:比较PichiaPink表达系统和巴斯德毕赤酵母GS115在表达外源蛋白方面的差异,对PichiaPink表达系统的潜在优点进行评价.方法:以重组人血清白蛋白-干扰素α2b融合蛋白(HSA-IFN-α2b)为报告蛋白,构建相关载体,分别转化PichiaPink系统菌株和巴斯德毕赤酵母GS115菌株,诱导HSA-IFN-α2b表达并测定表达水平；通过SDS-PAGE检测HSA-IFN-α2b在PichiaPink系统中的降解程度.结果:PichiaPink系统几乎所有的转化子都可以表达HSA-IFN-α2b,而GS115菌株只有60％的转化子能表达HSA-IFN-α2b;同一种Pink菌株中,整合有高拷贝数表达载体pPink-HC的菌株表达量高于整合有低拷贝数表达载体pPink-LC的菌株；Pink蛋白酶缺陷菌株在复杂培养基(YPD,BMMY)中HSA-IFN-α2b基本没有降解,而在合成培养基(BSM)中降解现象明显.结论:PichiaPink表达系统产生的转化子较GS115菌株产生的转化子易于筛选；PichiaPink系统蛋白酶缺陷菌株可明显减少外源蛋白降解.这些结果为利用PichiaPink表达系统高水平和大规模制备外源蛋白提供了实验依据.【总页数】5页(P818-822)【作者】任敏;赵洪亮;薛冲;沈非;杜济良;陈冬生;刘志敏【作者单位】安徽师范大学生命科学学院,安徽芜湖241000;军事医学科学院生物工程研究所,北京100071;军事医学科学院生物工程研究所,北京100071;军事医学科学院生物工程研究所,北京100071;安徽师范大学生命科学学院,安徽芜湖241000;军事医学科学院生物工程研究所,北京100071;军事医学科学院生物工程研究所,北京100071;安徽师范大学生命科学学院,安徽芜湖241000;军事医学科学院生物工程研究所,北京100071【正文语种】中文【中图分类】Q78【相关文献】1.重组人血清白蛋白-干扰素α-2b 融合蛋白体外抗乙型肝炎病毒活性评价 [J], 张伟;代晓朋;王鲁燕;武福军;祁碧玉;刘志敏;李军锋;周育森2.注射用重组人血清白蛋白-干扰素α2b融合蛋白生物学活性检测方法学研究 [J], 陈通威;杜莹莹;薛冲;武福军;张娜3.注射用重组人血清白蛋白-干扰素α2b融合蛋白生物学活性检测方法学研究 [J], 陈通威;杜莹莹;薛冲;武福军;张娜4.人血清白蛋白和人干扰素α2b的融合蛋白在毕赤酵母中的表达 [J], 唱韶红;巩新;杨志愉;王同映;马国昌;马清钧;吴军5.重组人血清白蛋白与干扰素α-2b融合蛋白中聚乙二醇1500残余量测定方法研究 [J], 张娜; 杜莹莹; 李月; 常早荣; 薛冲; 刘志敏; 任飞因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

人白介素-2融合蛋白的表达与发酵的开题报告

人血清白蛋白/人白介素-2融合蛋白的表达与发酵的开题报告一、研究背景及意义人血清白蛋白（HSA）是一种重要的蛋白质，能够在体内运输和调节各种物质的平衡，具有极高的生物活性和生物安全性，因此在医药领域得到了广泛应用。

同时，人白介素-2（IL-2）也是一种重要的细胞因子，能够刺激和调节免疫系统的功能，被广泛应用于肿瘤、自身免疫疾病等领域的治疗。

将HSA和IL-2进行融合，可以产生一种具有更强生物活性和更好药效的融合蛋白，因此引起了广泛关注。

蛋白质表达和发酵技术是蛋白质工程技术领域的关键技术之一，被广泛应用于多种蛋白质的制备和研究。

通过选择合适的基因表达载体和宿主菌，优化培养条件，可以高效地表达目标蛋白质，并获得高纯度的蛋白质产品。

因此，本课题拟通过表达和发酵技术，建立一套高效、稳定和可控的HSA-IL-2融合蛋白的生产工艺，为该项疾病的研究和治疗提供手段和技术支撑。

二、研究内容和方法1. HSA-IL-2融合蛋白的基因克隆本实验将利用分子生物学技术，设计并合成HSA和IL-2的基因，采用PCR扩增技术将两个基因连接在一起，构建HSA-IL-2融合基因。

2. HSA-IL-2融合蛋白的表达载体构建本实验将采用基因重组技术，将HSA-IL-2融合基因插入到适当的表达载体中，如pET表达载体，构建酵母表达载体。

3. HSA-IL-2融合蛋白的宿主菌选择和发酵条件优化本实验将采用大肠杆菌作为表达宿主菌，通过培养温度、培养基成分和培养条件等因素的优化，获取表达效率高的宿主菌，同时改善蛋白质的表达量和纯化效率。

4. HSA-IL-2融合蛋白的纯化和鉴定本实验将利用离子交换、凝胶过滤等技术对表达的融合蛋白进行纯化，检测及鉴定其生物活性和纯度。

三、预期结果和意义该研究旨在建立HSA-IL-2融合蛋白的表达和发酵工艺，预计可达到以下预期结果：1.成功构建基于大肠杆菌和酵母的HSA-IL-2融合蛋白表达系统；2.成功优化培养条件，提高表达效率和纯化效率，并获得高纯度的HSA-IL-2融合蛋白；3.成功证明HSA-IL-2融合蛋白具有更强生物活性和更好药效，具有在肿瘤和自身免疫疾病领域的广阔应用前景。

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５９８食品与生物技术学报第２９卷的产物，经ＥｃｏＲＩ和ＮｏｔＩ双酶切得到长约２．２ｋｂ的插入片断和长约９．３ｋｂ的载体片断，表明融合基因已经成功插入到载体ｐＰＩＣｇｋ中。

质粒测序结果显示，全部序列没有发生突变，与预期一致。

１．ＧｅｌｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｏｆＩＬ２ｍｌ２．ＧｅｌｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｏｆｐＢｌｕｅ／ＨＳＡ，３．ＤｉｇｅｓｔｉｏｎｏｆｐＢＨＩｍｗｉｔｈＥｅｏＲＩ＃４．Ｄｏｕｂｌｅｄｉｇｅｓ—ｔｉｏｎｏｆｐＢＨＩｍｗｉｔｈＥｃｏＲｌ／Ｎｏｔｌ；Ｍ．ＸＤＮＡ／ＨｉｎｄⅢＭａｒｋｅｒ圈１重组质粒ｐＢＨｌｍ的酶切分析Ｆｉｇ．１ＲｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎａｎａｌｙｓｉｓｏｆｔｈｅｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｐｌａｓｍｉｄｐＢＨｌｍ３．３阳性转化子的筛选及诱导产物的Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ鉴定质粒ｐＰＨＩｍ经ＳａｌＩ酶切，回收线性化片断，电击转化Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓＧＳｌｌ５感受态细胞。

涂布ＭＤ平板，３０℃培养４ｄ后共长出了约４００个转化子，挑选其中２００个菌落进行初筛，选其中表达量较高的１０株重组菌进行复筛验证，得到一株产量最高的重组菌Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓＧＳｌｌ５／ｐＰＨＩｍ，诱导３ｄ后上清液的ＳＤ§ＰＡＧＥ分析和Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ结果如图３所示。

３’ＡＩＬ２ｍ１．ＤｉｇｅｓｔｉｏｎｏｆｐＰＩＣ９ＫｗｉｔｈＥｃｏＲｌ；２．ＤｉｇｅｓｔｉｏｎｏｆｐＰＨＩｍｗｉｔｈＥｃｏＲＩ；３．ＤｏｕｂｌｅｄｉｇｅｓｔｉｏｎｏｆｐＰＨＩｍｗｉｔｈＥｃｏ—Ｒｌ／ＮｏｔＩ；Ｍ．）．ＤＮＡ／ＨｉｎｄⅢＭａｒｋｅｒ图２重组质粒ｐＰＨＩｍ的物理图谱（Ａ）和酶切分析（Ｂ）Ｆｉｇ．２ＰｈｙｓｉｃａｌｍａｐＩＡ）ａｎｄｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎａｎａｌｙｓｉｓ（Ｂ）ｏｆｔｈｅｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｐｌａｓｍｉｄｐＰＨｌｍ研究发现，表达的蛋白质的相对分子质量约为８２０００，与理论计算ＨＳＡ－ＩＬ２ｍ的相对分子质量相符，且这一位置的蛋白与１１．－２、ＨＳＡ的抗体都能发生免疫反应，进一步证实酵母经诱导表达ＨＳＡ—ＩＬ２ｍ。

但７００００和４５０００这两处的降解条带又都可以与ＨＳＡ的抗体发生免疫反应，认为是融合蛋白降解所产生的条带。

经白蛋白测定试剂盒测得其中白蛋白融合蛋白的量约为６０．２ｍｇ／Ｌ（以ＨＳＡ—ＩＬ２ｍ计）。

３．４诱导产物的活性测定发酵液经脱盐处理后，冻干保存。

取０．１ｍｇ冻干粉用２ｍＬＰＢＳ复溶后，离心取上清，测得其中融合蛋白的量约为３００／－ｇ／ｍＬ。

采用ＩＬ－２依赖细胞株ＣＴＬＬ一２以标准品ＩＬ－２为对照，对上清液中的融合蛋白的生物学活性进行了测定。

标准品的活性为２×１０５ＩＵ／ｍＬ，用ＲＰＭｌｌ６４０稀释到浓度为２００ＩＵ／ｍＬ。

测定结果表明，上清液中的融合蛋白可以有效的刺激ＣＴＬＬ－２细胞增殖。

以标准品的最高浓度ＯＤ啪值为１００ｏ／６，计算标准品、样品梯度百分率。

将百分率换算为概率单位，以概率单位为纵坐标，以稀释度Ｘ的对数为横坐标，绘制直线回归图（图４），通过计算得出融合蛋白粗蛋白的比活性为１．５１×１０６ＩＵ／ｍｇ。

第４期金光泽等：重组融合人血清白蛋白一人白介素一２Ｃ１２５Ａ突变体在毕赤酵母中的表达５９９Ｍ．Ｐｒｏｔｅｉｎｍａｒｋｅｒ；１．ＦｕｓｉｏｎｐｒｏｔｅｉｎＨＳＡ—ＩＬ２ｍ；２．ＰｒｏｔｅｉｎｅｘｐｒｅｓｓｅｄｂｙＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓＧＳｌ１５／ｐＰＩＣ９ｋ３．ＨＳＡ—ＩＬ２ｍ／ＩＬ２ａｎｔｉｂｏｄｙ。

４．ＨＳＡ～ＩＬ２ｍ／ＨＳＡａｎｔｉｂｏｄｙ图３融合蛋白ＨＳＡ－ＩＬ２ｍ的ＳＤＳ—ＰＡＧＥ分析（Ａ）和ＷｅｓｔｅｒｎＢｌｏｔ分析（Ｂ）Ｆｉｇ．３ＳＤｓ．ＰＡＧＥ（Ａ）ａｎｄＷｅｓｔｅｒｎＢｌｏｔ（Ｂ）ｏｆｔｈｅｆｕ－ｓｉｏｎｐｒｏｔｅｉｎＨＳＡ－ＩＬ２ｍ图４数据转换与线性回归的概率单位分析Ｆｉｇ．４Ｐｒｏｂｉｔｕｎｉｔａｎａｌｙｓｉｓｏｆｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎａｎｄｌｉｎｅａｒｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎｏｆｄａｔａ３．５融合蛋白的摇瓶诱导条件初步优化３．５．１初始ｐＨ对表达量的影响配制ＢＭＭＹ培养基时，将初始ｐＨ值分别调至５．０、５．５、６．ｏ、６．５，种子液培养３６ｈ后，经离心，用相同体积的ＢＭＭＹ液体培养基重悬菌体，２００ｒ／ｒａｉｎ，３０℃培养，每隔２４ｈ补加体积分数１％甲醇，７２ｈ后将发酵液离心并取上清，测定其中融合蛋白的含量。

结果如图５（ａ）所示，该菌表达ＨＳＡ—ＩＬ２ｍ的最适初始ｐＨ都在６左右，由于诱导培养基中含有０．１ｍｏｌ／Ｌ的磷酸钾缓冲液，测得的发酵液ｐＨ也基本在初始ｐＨ附近，因此可基本确定该菌的最适ｐＨ在６．０附近，这与Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司的介绍相符。

３．５．２甲醇体积分数对表达量的影响配制ＢＭ—ＭＹ培养基时，将初始ｐＨ调至６，二级种子培养３６ｈ后，用相同体积的ＢＭＭＹ液体培养基重悬菌体，２００ｒ／ｍｉｎ，３０℃培养，每隔２４ｈ按体积分数补加１％，２％，３％，４％甲醇，７２ｈ后将发酵液离心并取上清，测定其中融合蛋白的含量。

结果如图５（ｂ）所示，甲醇添加量为３％时ＨＳＡ－ＩＬ２ｍ的表达量最高。

３．５．３转速对表达量的影响配制ＢＭＭＹ培养基时，将初始ｐＨ调至６，二级种子培养３６ｈ后，用相同体积的ＢＭＭＹ液体培养基重悬菌体。

分别采用旋转式摇床１５０、２００、２５０ｒ／ｍｉｎ，往复式摇床１００、２００ｒ／ｍｉｎ，３０℃培养，每隔２４ｈ按体积补加甲醇３％，７２ｈ后将发酵液离心并取上清，测定其中ＨＳＡ—ＩＬ２ｍ的含量。

结果如图５（ｃ）所示，１００（Ｗ）、２００（ｗ）为往复式摇床转速），在装液量体积ｌｏ％条件下，随转速上升，表达量呈上升趋势。

相同转速下往复式摇床的溶氧要高于旋转式摇床，说明毕赤酵母在诱导期间对溶氧的需求量非常大，由于摇床转速的限制，确定最适的摇床转速为往复式２００ｒ／ｒａｉｎ。

３．５．４诱导相与生长相培养基体积比对表达量的影响配制ＢＭＭＹ培养基时，将初始ｐＨ调至６，二级种子培养３６ｈ后，用１：１、１：０．５、１：０．３倍体积的ＢＭＭＹ液体培养基重悬菌体，分别采用往复式摇床２００ｒ／ｒａｉｎ，３０℃培养，每隔２４ｈ按体积补加甲醇３％，７２ｈ后将发酵液离心并取上清，测定其中ＨＳＡ－ＩＬ２ｍ的含量。

结果如图５（ｄ）所示，该菌在１：０．５这个浓缩倍数下，表达量较高，在有充分的溶氧和合理的培养基的组分的情况下，随着细胞密度的增加，目的蛋白的表达量会逐渐增加。

由于本文研究的是在摇床条件下表达目的蛋白，当细胞密度达到一定值的时候，溶氧就成了限制菌体代谢和目的蛋白表达的重要因素，所以研究细胞密度对融合蛋白表达量的影响是有必要的。

重组融合人血清白蛋白-人白介素-2 C125A突变体在毕赤酵母中的表达作者：金光泽，段作营，张莲芬，金坚，李华钟， JIN Guang-ze， DUAN Zu-ying， ZHANG Lian-fen， JIN Jian， LI Hua-zhong作者单位：金光泽,段作营,李华钟,JIN Guang-ze,DUAN Zu-ying,LI Hua-zhong(江南大学,工业生物技术教育部重点实验室)，张莲芬,金坚,ZHANG Lian-fen,JIN Jian(江南大学,医药学院,江苏,无锡,214122)刊名：食品与生物技术学报英文刊名：JOURNAL OF FOOD SCIENCE AND BIOTECHNOLOGY年，卷(期)：2010,29(4)被引用次数：4次1.Kim HP;Imbert J;Leonard W Both integrated and differential regulation of components of the IL-2/IL-2 receptor system[外文期刊] 2006(05)2.常志远;徐荻白细胞介素2的研究进展[期刊论文]-中国处方药 2004(8)3.蒋春雷;徐荻;郑仲承白细胞介素-2的中枢镇痛作用[期刊论文]-中国应用生理学杂志 1994(04)4.Alice KP;Jorge AT Therapeutic use of interleukin-2 in HIV-infected patients[外文期刊] 2002(4)5.Grace Ju;Lisa C;Kimberlee L Structure-Function analysis of human interleukin-2 1994(12)6.李洁;张莲芬;孙均铭人C-型利钠肽-血清白蛋白融合蛋白质的构建及在毕赤酵母中的分泌表达[期刊论文]-中国生化药物杂志 2007(05)7.Version E;Carlsbad CA Multi-copy Pichia Expression Kit 19998.周道洪;沈元珊;赵曼瑞测定淋巴细胞转化和鼠白细胞介素2活性的新方法--MTT比色分析法 1986(01)9.Samrook J;Pritsch EF;Maniatis T Molecular cloning:a laboratory manual 199010.Scorer CA;Buckholz RG;Clare JJ The intracellular production and secretion of HIV-envelope protein in the methylotropic yeast Pichia pastoris[外文期刊] 199311.Roberts M J;Bentley MD;Harris JM Chemistry for peptide and protein PEGylation 2002(04)12.郭美锦;庄英萍;储炬重组巴氏毕赤酵母高密度发酵表达rHSA[期刊论文]-微生物学报 2002(01)1.张琦人β干扰素与人血清白蛋白融合蛋白的高产菌株筛选及制备工艺[学位论文]20092.王舒.郑志永.詹晓北.史仲平.高敏杰.刘立明.金坚.李华钟.Wang Shu.Zheng Zhiyong.Zhan Xiaobei.Shi Zhongping.Gao Minjie.Liu Liming.Jin Jian.Li HuaZhong重组毕赤酵母表达人血清白蛋白-人白介素2融合蛋白过程的代谢特性[期刊论文]-食品与发酵工业2008,34(8)3.郭泽峰.段作营.张莲芬.金坚.李华钟.GUO Ze-feng.DUAN Zuo-ying.ZHANG Lian-fen.JIN Jian.LI Hua-zhong 人白介素-2/人血清白蛋白融合蛋白在毕赤酵母中的表达[期刊论文]-中国药科大学学报2008,39(1)1.李波.段作营.张红梅.雷楗勇.陈蕴.唐瑜菁.金坚.李华钟人白介素2-人血清白蛋白融合蛋白的纯化及活性鉴定[期刊论文]-食品与生物技术学报 2012(3)2.罗文.雷楗勇.金坚重组人白细胞介素2-人血清白蛋白融合蛋白的液态稳定性[期刊论文]-食品与生物技术学报2013(2)3.钱凯.雷楗勇.关波.陈蕴.饶志明.金坚人血清白蛋白和干扰素α2b融合蛋白在毕赤酵母中表达及质量控制[期刊论文]-食品与生物技术学报 2012(12)4.张慧敏.李剑芳.邬敏辰.魏喜换.杨严俊耐热木聚糖酶基因在毕赤酵母中的表达及酶学性质[期刊论文]-食品与生物技术学报 2013(2)引用本文格式：金光泽.段作营.张莲芬.金坚.李华钟.JIN Guang-ze.DUAN Zu-ying.ZHANG Lian-fen.JIN Jian.LI Hua-zhong重组融合人血清白蛋白-人白介素-2 C125A突变体在毕赤酵母中的表达[期刊论文]-食品与生物技术学报 2010(4)。