重组融合人血清白蛋白-人白介素-2+C125A突变体在毕赤酵母中的表达

５９８食品与生物技术学报第２９卷

的产物，经ＥｃｏＲＩ和ＮｏｔＩ双酶切得到长约２．２ｋｂ

的插入片断和长约９．３ｋｂ的载体片断，表明融合基

因已经成功插入到载体ｐＰＩＣｇｋ中。质粒测序结果

显示，全部序列没有发生突变，与预期一致。

１．ＧｅｌｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｏｆＩＬ２ｍｌ２．ＧｅｌｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｏｆｐＢｌｕｅ／

ＨＳＡ，３．ＤｉｇｅｓｔｉｏｎｏｆｐＢＨＩｍｗｉｔｈＥｅｏＲＩ＃４．Ｄｏｕｂｌｅｄｉｇｅｓ—

ｔｉｏｎｏｆｐＢＨＩｍｗｉｔｈＥｃｏＲｌ／Ｎｏｔｌ；Ｍ．ＸＤＮＡ／ＨｉｎｄⅢＭａｒｋｅｒ

圈１重组质粒ｐＢＨｌｍ的酶切分析

Ｆｉｇ．１Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎａｎａｌｙｓｉｓｏｆｔｈｅｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｐｌａｓｍｉｄ

ｐＢＨｌｍ

３．３阳性转化子的筛选及诱导产物的Ｗｅｓｔｅｒｎ

ｂｌｏｔ鉴定

质粒ｐＰＨＩｍ经ＳａｌＩ酶切，回收线性化片断，电

击转化Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓＧＳｌｌ５感受态细胞。涂布ＭＤ

平板，３０℃培养４ｄ后共长出了约４００个转化子，挑

选其中２００个菌落进行初筛，选其中表达量较高的

１０株重组菌进行复筛验证，得到一株产量最高的重

组菌Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓＧＳｌｌ５／ｐＰＨＩｍ，诱导３ｄ后上清液

的ＳＤ§ＰＡＧＥ分析和Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ结果如图３

所示。

３’ＡＩＬ２ｍ

１．ＤｉｇｅｓｔｉｏｎｏｆｐＰＩＣ９ＫｗｉｔｈＥｃｏＲｌ；２．ＤｉｇｅｓｔｉｏｎｏｆｐＰＨＩｍｗｉｔｈ

ＥｃｏＲＩ；３．ＤｏｕｂｌｅｄｉｇｅｓｔｉｏｎｏｆｐＰＨＩｍｗｉｔｈＥｃｏ—Ｒｌ／ＮｏｔＩ；Ｍ．）．ＤＮＡ／ＨｉｎｄⅢＭａｒｋｅｒ

图２重组质粒ｐＰＨＩｍ的物理图谱（Ａ）和酶切分析

（Ｂ）

Ｆｉｇ．２ＰｈｙｓｉｃａｌｍａｐＩＡ）ａｎｄｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎａｎａｌｙｓｉｓ（Ｂ）ｏｆ

ｔｈｅｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｐｌａｓｍｉｄｐＰＨｌｍ

研究发现，表达的蛋白质的相对分子质量约为８２０００，与理论计算ＨＳＡ－ＩＬ２ｍ的相对分子质量相

符，且这一位置的蛋白与１１．－２、ＨＳＡ的抗体都能发

生免疫反应，进一步证实酵母经诱导表达ＨＳＡ—

ＩＬ２ｍ。但７００００和４５０００这两处的降解条带又都

可以与ＨＳＡ的抗体发生免疫反应，认为是融合蛋

白降解所产生的条带。经白蛋白测定试剂盒测得

其中白蛋白融合蛋白的量约为６０．２ｍｇ／Ｌ（以

ＨＳＡ—ＩＬ２ｍ计）。

３．４诱导产物的活性测定

发酵液经脱盐处理后，冻干保存。取０．１ｍｇ冻干粉用２ｍＬＰＢＳ复溶后，离心取上清，测得其中

融合蛋白的量约为３００／－ｇ／ｍＬ。采用ＩＬ－２依赖细

胞株ＣＴＬＬ一２以标准品ＩＬ－２为对照，对上清液中的

融合蛋白的生物学活性进行了测定。标准品的活

性为２×１０５ＩＵ／ｍＬ，用ＲＰＭｌｌ６４０稀释到浓度为

２００ＩＵ／ｍＬ。测定结果表明，上清液中的融合蛋白

可以有效的刺激ＣＴＬＬ－２细胞增殖。以标准品的

最高浓度ＯＤ啪值为１００ｏ／６，计算标准品、样品梯度

百分率。将百分率换算为概率单位，以概率单位为

纵坐标，以稀释度Ｘ的对数为横坐标，绘制直线回

归图（图４），通过计算得出融合蛋白粗蛋白的比活

性为１．５１×１０６

ＩＵ／ｍｇ。

第４期金光泽等：重组融合人血清白蛋白一人白介素一２Ｃ１２５Ａ突变体在毕赤酵母中的表达５９９

Ｍ．Ｐｒｏｔｅｉｎｍａｒｋｅｒ；１．ＦｕｓｉｏｎｐｒｏｔｅｉｎＨＳＡ—ＩＬ２ｍ；２．ＰｒｏｔｅｉｎｅｘｐｒｅｓｓｅｄｂｙＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓＧＳｌ１５／ｐＰＩＣ９ｋ３．ＨＳＡ—ＩＬ２ｍ／ＩＬ２ａｎｔｉｂｏｄｙ。４．ＨＳＡ～ＩＬ２ｍ／ＨＳＡａｎｔｉｂｏｄｙ

图３融合蛋白ＨＳＡ－ＩＬ２ｍ的ＳＤＳ—ＰＡＧＥ分析（Ａ）和ＷｅｓｔｅｒｎＢｌｏｔ分析（Ｂ）

Ｆｉｇ．３ＳＤｓ．ＰＡＧＥ（Ａ）ａｎｄＷｅｓｔｅｒｎＢｌｏｔ（Ｂ）ｏｆｔｈｅｆｕ－ｓｉｏｎｐｒｏｔｅｉｎＨＳＡ－ＩＬ２ｍ

图４数据转换与线性回归的概率单位分析Ｆｉｇ．４Ｐｒｏｂｉｔｕｎｉｔａｎａｌｙｓｉｓｏｆｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎａｎｄｌｉｎｅａｒｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎｏｆｄａｔａ

３．５融合蛋白的摇瓶诱导条件初步优化

３．５．１初始ｐＨ对表达量的影响配制ＢＭＭＹ培养基时，将初始ｐＨ值分别调至５．０、５．５、６．ｏ、６．５，种子液培养３６ｈ后，经离心，用相同体积的ＢＭＭＹ液体培养基重悬菌体，２００ｒ／ｒａｉｎ，３０℃培养，每隔２４ｈ补加体积分数１％甲醇，７２ｈ后将发酵液离心并取上清，测定其中融合蛋白的含量。结果如图５（ａ）所示，该菌表达ＨＳＡ—ＩＬ２ｍ的最适初始ｐＨ都在６左右，由于诱导培养基中含有０．１ｍｏｌ／Ｌ的磷酸钾缓冲液，测得的发酵液ｐＨ也基本在初始ｐＨ附近，因此可基本确定该菌的最适ｐＨ在６．０附近，这与Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司的介绍相符。

３．５．２甲醇体积分数对表达量的影响配制ＢＭ—ＭＹ培养基时，将初始ｐＨ调至６，二级种子培养３６ｈ后，用相同体积的ＢＭＭＹ液体培养基重悬菌体，２００ｒ／ｍｉｎ，３０℃培养，每隔２４ｈ按体积分数补加１％，２％，３％，４％甲醇，７２ｈ后将发酵液离心并取上清，测定其中融合蛋白的含量。结果如图５（ｂ）所示，甲醇添加量为３％时ＨＳＡ－ＩＬ２ｍ的表达量最高。

３．５．３转速对表达量的影响配制ＢＭＭＹ培养基时，将初始ｐＨ调至６，二级种子培养３６ｈ后，用相同体积的ＢＭＭＹ液体培养基重悬菌体。分别采用旋转式摇床１５０、２００、２５０ｒ／ｍｉｎ，往复式摇床１００、２００ｒ／ｍｉｎ，３０℃培养，每隔２４ｈ按体积补加甲醇３％，７２ｈ后将发酵液离心并取上清，测定其中ＨＳＡ—ＩＬ２ｍ的含量。结果如图５（ｃ）所示，１００（Ｗ）、２００（ｗ）为往复式摇床转速），在装液量体积ｌｏ％条件下，随转速上升，表达量呈上升趋势。相同转速下往复式摇床的溶氧要高于旋转式摇床，说明毕赤酵母在诱导期间对溶氧的需求量非常大，由于摇床转速的限制，确定最适的摇床转速为往复式２００ｒ／ｒａｉｎ。

３．５．４诱导相与生长相培养基体积比对表达量的影响配制ＢＭＭＹ培养基时，将初始ｐＨ调至６，二级种子培养３６ｈ后，用１：１、１：０．５、１：０．３倍体积的ＢＭＭＹ液体培养基重悬菌体，分别采用往复式摇床２００ｒ／ｒａｉｎ，３０℃培养，每隔２４ｈ按体积补加甲醇３％，７２ｈ后将发酵液离心并取上清，测定其中ＨＳＡ－ＩＬ２ｍ的含量。结果如图５（ｄ）所示，该菌在１：０．５这个浓缩倍数下，表达量较高，在有充分的溶氧和合理的培养基的组分的情况下，随着细胞密度的增加，目的蛋白的表达量会逐渐增加。由于本文研究的是在摇床条件下表达目的蛋白，当细胞密度达到一定值的时候，溶氧就成了限制菌体代谢和目的蛋白表达的重要因素，所以研究细胞密度

对融合蛋白表达量的影响是有必要的。