突变株筛选
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实验三 氨基酸营养缺陷型突变 株的筛选
一、目的要求 目的要求
• • 了解营养缺陷型突变株选育的原理。 学习并掌握细菌氨基酸营养缺陷型的 诱变、筛选与鉴定方法。
二、基本原理
• 营养缺陷型是指野生型菌株由于某些物理因素 或化学因素处理，使编码合成代谢途径中某些 酶的基因突变，丧失了合成某些代谢产物(如 氨基酸、核酸碱基、维生素)的能力，必须在 基本培养基中补充该种营养成分，才能正常生 长的一类突变株。这类菌株可以通过降低或消 除末端产物浓度，在代谢控制中解除反馈抑制 或阻遏，而使代谢途径中间产物或分支合成途 径中末端产物积累。在氨基酸、核苷酸生产中 已广泛使用营养缺陷型菌株。
（四）涂CM（complete medium)平皿、培养突 变型 • 1.倒CM平板：(实验二中已完成） 。 • 2.稀释和涂CM平皿：(实验二Βιβλιοθήκη Baidu已完成）
（五）检出缺陷型 • 1.倒CM、MM（minimum medium）平板： 融化CM、MM培养基，各制备一个平板。 在平板下贴好画有20个小格的纸。 • 2.用逐个检出法检测 用牙签挑取20个长势 良好的菌落，先接在 MM培养基的一个位 点上，再接CM培养 基的相应位点上。 32度培养48小时。
五、结果与讨论
1、结合实验讨论影印法应用的局限性。 2、思考实验中出现的问题，今后将如何避 免？
（六）测定生长谱 1.制备MM平板 在培养皿底部划分5个区域，做好标记 2.将可能是营养缺陷型的菌株，制备菌悬液，接 种于平板上。 3.在相应的区域加入不同的氨基酸组，进行培养。
（七）鉴定缺陷型 观察菌的生长情况，确定氨基酸缺陷型。 1 组氨酸 苏氨酸 谷氨酸 组 2 3 别 4 6 天冬 氨酸 亮氨酸 甘氨酸
三、实验材料
1）菌种： （实验二诱变的）大肠杆菌 2）培养基： 细菌完全培养基（实验二中已配） ； 无氮基本培养基（实验二中已配） ； 3）仪器： 恒温培养箱等
四、实验步骤
（一）培养基制备、细菌对数期培养（已完成） （二）制备菌悬液、紫外线诱变 （已完成） •
（二）制备菌悬液、紫外线诱变
（三）淘汰野生型菌株 1.无氮、二倍氮培养： 将菌液离心洗涤后，加入5ML无氮培养基 中，饥饿培养2小时后，加入2倍氮培养基 【无氮培养基中加入0.2%（NH4）2SO4 】中 再培养2小时，恢复野生型的生长。 2.青霉素杀死野生型： 加入200U/ML的青霉素1ML，于30度下培 养。
一、目的要求 目的要求
• • 了解营养缺陷型突变株选育的原理。 学习并掌握细菌氨基酸营养缺陷型的 诱变、筛选与鉴定方法。
二、基本原理
• 营养缺陷型是指野生型菌株由于某些物理因素 或化学因素处理，使编码合成代谢途径中某些 酶的基因突变，丧失了合成某些代谢产物(如 氨基酸、核酸碱基、维生素)的能力，必须在 基本培养基中补充该种营养成分，才能正常生 长的一类突变株。这类菌株可以通过降低或消 除末端产物浓度，在代谢控制中解除反馈抑制 或阻遏，而使代谢途径中间产物或分支合成途 径中末端产物积累。在氨基酸、核苷酸生产中 已广泛使用营养缺陷型菌株。
（四）涂CM（complete medium)平皿、培养突 变型 • 1.倒CM平板：(实验二中已完成） 。 • 2.稀释和涂CM平皿：(实验二Βιβλιοθήκη Baidu已完成）
（五）检出缺陷型 • 1.倒CM、MM（minimum medium）平板： 融化CM、MM培养基，各制备一个平板。 在平板下贴好画有20个小格的纸。 • 2.用逐个检出法检测 用牙签挑取20个长势 良好的菌落，先接在 MM培养基的一个位 点上，再接CM培养 基的相应位点上。 32度培养48小时。
五、结果与讨论
1、结合实验讨论影印法应用的局限性。 2、思考实验中出现的问题，今后将如何避 免？
（六）测定生长谱 1.制备MM平板 在培养皿底部划分5个区域，做好标记 2.将可能是营养缺陷型的菌株，制备菌悬液，接 种于平板上。 3.在相应的区域加入不同的氨基酸组，进行培养。
（七）鉴定缺陷型 观察菌的生长情况，确定氨基酸缺陷型。 1 组氨酸 苏氨酸 谷氨酸 组 2 3 别 4 6 天冬 氨酸 亮氨酸 甘氨酸
三、实验材料
1）菌种： （实验二诱变的）大肠杆菌 2）培养基： 细菌完全培养基（实验二中已配） ； 无氮基本培养基（实验二中已配） ； 3）仪器： 恒温培养箱等
四、实验步骤
（一）培养基制备、细菌对数期培养（已完成） （二）制备菌悬液、紫外线诱变 （已完成） •
（二）制备菌悬液、紫外线诱变
（三）淘汰野生型菌株 1.无氮、二倍氮培养： 将菌液离心洗涤后，加入5ML无氮培养基 中，饥饿培养2小时后，加入2倍氮培养基 【无氮培养基中加入0.2%（NH4）2SO4 】中 再培养2小时，恢复野生型的生长。 2.青霉素杀死野生型： 加入200U/ML的青霉素1ML，于30度下培 养。