高等药物分析复习资料

1、简述现代药物分析较传统药物分析的新特点。

静态分析→动态分析
体外分析→体内分析
品质分析→生物活性分析
单一技术→联用技术
小样本分析→高通量分析
人工分析→计算机辅助分析
特点：（1）新的药物分析理论、方法、技术迅速发展，具有高通量、高灵敏、高选择性优点；（2）分析仪器自动化、数字化、仿生化和计算机化并向智能化、信息化方向发展；（3）药物分析测定对象、内容亦有很大的扩展。

如对药物的晶型和构型研究、药物中存在的有关物质（含降解产物）结构研究、手性药物的分离、药物代谢研究、基因工程药物分析、复杂物质分离分析（含中药成分分析）等。

2、简述现代药物分析的新进展主要有哪些方面。

①分析领域的发展：药物质量控制、手性药物分析、临床药学、中药与天然药物分析、药物代谢分析、法医毒物分析、兴奋剂检测、药物制剂分析、创新药物研究、药品上市后的评价。

②分析技术的发展：核磁共振波谱、荧光分析法、薄层色谱法、紫外-可见分光光度法、高效液相色谱法，毛细管电泳，多维色谱及联用技术。

色谱-光谱联用技术使高分离性能的液相色谱技术与能够获得丰富化学结构信息的光谱技术相结合，是现代药学研究领域中最强有力的分析工具之一。

3、常用的手性固定相有哪些？并简述其各自的原理。

①环糊精衍生物手性固定相：拆分机制一般认为是由于环糊精特殊的桶状结构，可与对映体形成非对映的包合物而达到拆分目的。

②冠醚类手性固定相：用手性冠醚作固定相分离手性化合物的主要依据是溶质分子与手性冠醚环腔形成主客体络合物的稳定常数不同. 冠醚的手性“臂障"越大,其手性识别能力越高.
③多糖类手性固定相：它们本身表现出一定的手性识别能力，但其直接做固定相选择性低，然而其衍生物作为CSP 具有较高的手性识别能力,能拆分大量的对映体。

④Pirkle型手性固定相(刷型固定相)：该类固定相通过含末端梭基或异氰酸酷基手性前体与氨基键合硅胶进行缩合反应，分别形成含酞胺或服型结构CSP，广泛用于氨基酸、乙内酞脉、内酞脉、胺类、醇类及硫醇类药物对映体拆分。

⑤配体交换型(L EC)手性固定相：是利用配体交换的分离机制而制成的固定相，即一个金属离子可结合一个配体分子和一个对映体溶质分子，形成可逆的非对映体复合物，以达到分离对映体的目的，这类手性固定相的液相色谱多用于氨基酸或者肽类的拆分，这类色谱多用含水流动相，其中加入适量螯合的金属离子.
⑥大环抗生素类手性固定相：是将包含多个手性中心的大环抗生素固定到硅胶上形成的一类用于对映体拆分的新型手性固定相。

⑦分子印迹手性固定相：它是将功能单体,在模板分子(目标分子,又称印迹分子)的存在下,交联聚合,然后洗脱除去模板分子,这样制得的聚合物,在空间结构和功能基排布上与目标
分子具有互补结构的空穴,因此在分子识别中有着特殊的选择性和良好的应用前景.
⑧蛋白质类手性固定相：其具有大量不同的可与样品分子结合的部位,此外样品组分的保留和选择性易受流动相的pH、离子强度、有机溶剂等影响,因此蛋白质CSP的手性选择性较其他CSP 要高,是高效液相色谱分离中最具吸引力的手性固定相之一
⑨手性聚合物固定相：该类固定相使用最多的有两种:一种是通过在手性条件下不对称聚合制备的，如用手性催化剂。

另一种是用手性单体的方法制备的。

用这两种技术可制备有手性识别功能的聚合物，如聚甲基丙烯的三苯甲酷，聚酞胺等，这类手性聚合物可涂渍或键合到硅胶上制成CSP。

4、手性高效液相色谱法的分类有哪些？并简述其各自的原理。

(1)间接法：对映体的混合物与手性试剂结合，形成一对非对映异构体，然后以常规固定相或手性方法分离，这种方法也称为柱前衍生化法或手性衍生化试剂法(CDR)。

此法主要适用于不宜直接拆分的样品，无须使用价格昂贵的手性柱。

但此法对衍生化试剂纯度要求较高，所使用的衍生化试剂必须具有足够的光学纯度和稳定性，在衍生化反应和色谱条件下稳定。

且衍生化条件复杂，费时费力，所得单一对映体有时不易与衍生化试剂分离。

但该法仍不失为一种普遍、高效的对映体拆分方法。

(2)直接法：不做柱前衍生化处理，直接以手性固定相或手性流动相拆分的方法，称为直接法。

又分为手性固定相法(CSP)和手性流动相添加剂法(CMPA)。

手性固定相(CSP)法是以手性固定相直接与对映体外消旋物相作用，因生成的短暂的复合物稳定性不同，从而引起二者柱内保留时间不同而进行分离的方法。

目前，以商品出售的手性固定相有上百种之多，具有简便、快速、立体选择性强、适用范围广等优点。

手性流动相添加剂法(CMPA)又称手性添加剂法，这种拆分法是在流动相中加入手性试剂，利用手性试剂与各对映体结合的稳定常数不同，以及药物与结合物在固定相上分配系数的不同来进行分离。

此法不需昂贵的手性柱，亦无须进行柱前衍生，手性添加剂可视要求而更换，使用比较方便。

5、毛细管电泳的种类有哪些？毛细管电泳分离的驱动力是什么？毛细管电泳比高效液相色谱高效的原因是什么？
种类：毛细管电泳根据分离模式的不同，可以分为毛细管区带电泳(CZE)、胶束电动毛细管色谱(MECC或MEKC)、毛细管凝胶电泳(CaPillary Gel Electrophoresis，CGE)、毛细管电色谱(CaPillary eleetrochromatogaphy，CEC)、毛细管等电聚焦(CaPillary isoeleetric focusing，CIEF)、毛细管等速电泳(CaPillary Isotachophoresis，CITP)等。

毛细管区带电泳(CZE)是毛细管电泳的最基本的工作方式。

它的分离机制是基于各被测物质在溶液中的淌度差异，影响组分淌度的因素有组分的荷质比、结构和体积。

CZE是最简单也是应用最广的一种模式，可用于氨基酸、肤、蛋白质、简单离子和对映体等分析。

胶束电动毛细管色谱(MEKC)是采用表面活性剂在运行缓冲液内形成动态胶束，利用样品各组分在水相、胶束相两相间分配行为上的差异进行分离，是色谱技术和电泳技术的结合。

毛细管凝胶电泳(CGE)是将凝胶充入毛细管中作支持物，不同体积的溶质分子在起分子筛作用的凝胶中得以分离。

凝胶粘性大、抗对流、能减少溶质扩散，柱效极高，但是CGE 制备困难，易产生空泡。

后来发展了无胶筛分，用粘度低的线性聚合物溶液代替高粘度的聚丙烯酞胺，同样起到了分子筛的作用，而且比凝胶柱便宜、寿命长，但是柱效稍低。

CGE 现己广泛用于DNA片段的分析。

毛细管等电聚焦(CIEF)用两性电解质在毛细管内建立pH梯度，使各种不同等电点的蛋白质在电场的作用下迁移到等电点的位置，形成一非常窄的聚焦区带。

可用于测定蛋白质的
等电点、分离异构体和其它方法难以分离的蛋白质。

毛细管等速电泳(CITP)可用较大内径的毛细管，在微制备中很有用途，可作为柱前浓缩方法用于富集样品。

毛细管阵列电泳(CapillaryArrayEleetrophoresiS，CAE)的分离模式渐渐呈现出了广阔的应用发展前景和趋势。

与传统聚丙烯酞胺凝胶板电泳相似，可以进行多道平行分析，毛细管阵列电泳即是采用多根毛细管组成的阵列进行多道分析的一种分离模式。

毛细管电泳分离的驱动力：在毛细管中阳离子、中性分子和阴离子自身淌度或/和分配系数不同。

在高效毛细管电泳中，电渗流是推动溶液移动的驱动力，它使柱中溶液整体向前匀速移动，界面滞留现象很小，即以塞式移动（平流），而高效液相色谱中则是以抛物线形状流动（层流），故高效毛细管电泳中的峰展很小，柱效要高的多。

6、HPLC-ESI-MS联用分析条件选择时需考虑的主要因素有哪些？
流动相：常用流动相为水，甲醇、乙腈及它们的混合物，需要调节pH时还可使用醋酸、甲酸或它们的铵盐溶液，应避免磷酸盐或离子对试剂等。

流量：流量对分析也有较大的影响，要根据柱内径和接口的不同来选择流量。

较小的流速可获得较好离子化效率。

尽量选内径小的色谱柱。

但是要兼顾分析速度的因素，因此多采用内径2.1mm的色谱柱，0.2~0.4ml/min的流速。

离子检测模式：碱性物质选择正离子检测模式，可用醋酸或甲酸使试样酸化至pH=pKa-2；酸性物质，pH值在（pKa+2），负离子检测。

温度：接口的干燥气体温度应高于待分析物沸点20℃左右，同时要考虑物质的热稳定性和流动相中有机溶剂的比例。

7、在进行天然药物HPLC-UV分析时，是否可以直接对得到的单一色谱峰进行含量测定？
一般来说是不可以直接对得到的单一色谱峰进行含量测定。

HPLC-UV作定量分析，依据的是峰面积（早期也用过峰高），而峰面积会因多种因素而变化：①色谱柱②流动相③柱温。

上述三个因素都会导致保留时间的变化，峰面积也会因此有大小不同的变异。

另外就是UV检测器，波长的准确度会因使用时间，仪器设计（如杂散光大小），环境温湿度的改变等而变化，如果待测物的最大吸收峰的带宽较窄，或采用末端吸收的时候，尤其明显。

所以作含量测定的时候一般都用规范曲线法或规范对照法。

另外值得注意的是所谓单一色谱峰，并不一定是单一化合物，需要对峰的纯度作判断。

但是在某些情况下，也可以直接对得到的单一色谱峰，作出含量（浓度）判断。

比如同一类化合物（如黄芪皂苷类，黄酮类），可以用随行的一个化合物的标样来估算别的化合物，因为它们的紫外特征很相似，这也是归一化法的基础；再比如同一套色谱系统上测出的校正因子或工作曲线，在以后的几天内，可能变化不大，那么这几天也可以不随行标样。

8、简述高速逆流色谱的原理。

9、简述胶束形成的条件和原理，以及胶束在分析中的特点。

条件：胶束是表面活性剂在溶液中的浓度超过某一临界值后，其分子或离子自动缔合成的胶体大小的聚集体质点微粒，这种胶体质点与离子之间处于平衡状态。

原理：单个表面活性剂分子在溶于水后，完全被水分子包围，分子中的亲水基团有被水吸引的趋势，而亲油基团则被水排斥，因此表面活性剂分子占据溶液表面，在表面吸附，将其亲油基团伸向空气。

这种表面吸附达到饱和后，如果表面活性剂的浓度继续增加，则溶液内部的表面活性剂分子将采取另一种对水进行排斥的方式，即分子中的长链亲油基团通过分子间吸引力相互缔合，自身相互抱成团，而亲水基团则伸向水中，与水分子结合，形成聚集体，即胶束。

特点：胶束具有增敏作用，提高分析检测的灵敏度。

胶束具有增稳作用，提高反应体系或分析体系的稳定性。

此外胶束还具有增加对比度的作用。

其中胶束液相色谱法还可以提高色谱分离的选择性。

毛细管胶束电泳色谱分离原理：MECC中存在有两相，一相是以胶束形式存在的准固定相，另一相是作为载体的液相，又称流动相。

试样中的组分在MECC中的分离，从本质上来说，是由它们的分子和胶束相及流动相分子之间的相互作用的差异造成的，尽管对不同的胶束相互作用的形式不同，但是它们所反映的问题本质是一样的。

具体来说，溶质在毛细管柱内受到两种力，一是胶束对它的作用力，二是流动相的溶解力，即溶质处于两个作用力场的平衡之中，作用力强，溶解力差时，溶质有较大的保留。

反之，则较早流出毛细管柱，见图4.3.
也就是说，不同组分分子和胶束相与流动相分子相互作用的不同，最终将导致它们在两相中的浓度比不同，或者说分配系数不同。

设X物质因相互作用较大，而在胶束相中的浓度较大，Y物质因相互作用较小而浓度较小，则X的分配系数大于Y的分配系数（分配系数K=溶质在胶束相的浓度/溶质在流动相的浓度），在这一MECC系统中，X在Y的后面流出。

综上所述，不同组分在毛细管胶束电动色谱中的分离，从根本上来说是由于它们的分子与胶束和流动相分子相互作用的差异造成的，而这种相互作用的差异通过分配系数的差异来反映，分配系数和上述一系列微观参量都有明确的定量关系。

10、ELISA检测试剂盒的技术和应用。

ELISA是一种免疫测定（immunoassay，IA）。

基础:抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。

加入酶反应的底物后，底物被酶催化成为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，由此进行定性或定量分析。

ELISA的基本原理是将特异的抗原-抗体免疫学反应和酶学催化反应相结合，以酶促反应的放大作用来显示初级免疫反应，它既可测抗原，也可测抗体。

ELISA用固相载体吸附
抗体(抗原)，加待测抗原(抗体)，再与相应的酶标记抗体(抗原)进行抗原抗体的特异免疫反应，生成抗体(抗原)- 待测抗原(抗体)-酶标记抗体(抗原)的复合物，最后再与该酶的底物反应生成有色产物待测抗原(抗体)的定量与有色产物量成正比，根据吸光度值计算抗原(抗体)的量ELISA 法既可进行定性，又可进行定量测定。

一般采用商品化的试剂盒进行测定。

完整的ELISA 试剂盒包含7个组分：包被了①抗原或抗体的固相载体，②酶标记的抗原或抗体，③酶的底物，④阴性和阳性对照品，参考规范品,控制血清，⑤结合物及标本的稀释液,⑥洗涤液⑦酶反应终止液。

，
分类：主要技术类型有双抗体夹心法间接法捕获法竞争法
应用：由于ELISA(酶联免疫吸附实验,酶联免疫试剂盒)具有快速、敏感、简便、易于规范化等优点，使其得到迅速的发展和广泛应用。

目前ELISA(酶联免疫吸附实验,酶联免疫试剂盒)方法已被广泛应用于多种细菌和病毒等疾病的诊断、动物检疫方面、兽药残留检测中应用的、农药残留检测、动物性食品中药物残留检测、生物毒素的检测、转基因食品安全性的检测。

11、简述药物分析实验方法学验证的内容及其具体含义、表示方法等。

①准确度：指该方法准确性指的是测量值与真实值或认可的参考值之间相近程度。

一般用百分回收率表示。

②精密度：在规定的条件下，用该法测得的一组测量值彼此之间的接近程度。

一般用偏差、规范偏差或相对规范偏差（变异系数）来表示。

③专属性（选择性）：专属性是指在一些可能存在的组分如杂质、降解产物、基质等的存在下，对被分析物质的准确可靠的测定。

专属性常用添加了杂质、降解产物、相关化合物的样品与未曾添加的样品所得的分析结果的偏离程度来表示。

④检测限：是指试样中被测物能被检测出的最低量。

常用百分数、ppm、ppb表示。

⑤定量限：指样品中北侧无能被定量测定的最低量，其测定结果应具有一定的准确度和精密度。

常用信噪比法来确定。

⑥线性：是指设计的范围内，测量结果与试样中被测物浓度直接呈正比关系的程度。

常考察浓度与信号的线性程度来表示。

⑦范围：指能达到一定精密度、准确度和线性的条件下，该测试方法使用的高低限浓度或量的区间。

需考虑方法的具体应用、线性、准确度、精密度结果和要求来确定。

⑧耐用性：是指在测定条件有少的变动时，测定结果不受影响的承受程度。

经常用考察不同条件进行实验结果来确定方法的耐用性。

12、简述质量规范制订的基础、原则，以及起草说明的原则。

（P489）
制订基础：在新药的研究开发期间，要对新药的制备工艺、结构确认、一般药理学、主要药效学、毒理学等方面进行研究，还需要进行系统的质量研究和药品稳定性考察
原则：①药品的安全性和有效性
②方法的科学性和先进性
③控制指标的针对性和合理性
起草说明的原则：
A原料药质量规范的起草说明应包括下列内容
①简况：说明本品的临床用途；我国投产历史，有关工艺改革及重大科研成就；国外药典收载情况；目前国内生产情况和质量水平。

②生产工艺：用化学反应式表明合成的路线，或用简明的工艺流程表示；要说明成品的精制方法及可能引入成品中的杂志。

如国内生产采用有不同的工艺路线或精制方法，应分别列出，
并尽可能注明生产厂家。

③规范制订的意见或理由：按规范内容依次说明（包括产品质量的具体数据或生产厂检验结果的统计）。

对鉴别、检查和含量测定方法，除已载入药典附录以外，要根据现有资料（引用文献）说明其原理，特别是操作中的注意事项应加以说明。

对个别进行过方法学研究的工程，应另附专题研究报告。

④与国外药典及原规范进行对比，并对本规范的水平进行评价。

⑤列出起草单位和复核单位对本规范的意见（包括本规范中尚存在的问题，以及今后的改进意见）。

⑥列出主要的参考文献
B新增制剂规范的起草说明还应包括
①处方：列出附加剂的品名和用量，如国内生产有多种处方时，应尽可能分别列出（注明生产厂），并进行比较。

②制法：列出简要的制备方法。

③规范制订的意见和理由：除了与新增原料药要求相同外，还应有对制剂的稳定性考察材料并提出有效建议的说明。

C上版药典已收载品种的修订说明对修订部分，根据下列情况分别说明：
①对附录方法有实质性修改的工程（如崩解时限检查法、栓剂、气雾剂），应说明照新附录对产品进行考核的结果，并列出具体数据；
②对原规范的检验方法进行过修改的工程，或新增的检验工程，要说明增修订的理由、方法和来源，并写出产品的检验数据，含量测定方法的修改要附有专题研究材料；对原规范限度的修改，要说明理由并列表说明当时产品的检验数据，以及与国外药典相应工程的比较。

对于不修订的部分，要写出综合材料说明不修订的理由。

D其他值得强调的是，起草说明中应阐明曾经做过的有关实验，包括不成熟的、尚待完善的或失败的，暂未或不能收载于正文的检定方法的理由，并提供相关的实验资料，以便有关部门审查其实验设计是否合理，以确定为主观或客观原因，从而判定是否需要做进一步的实验。

起草说明的书写格式应按质量规范工程依次予以说明，与其研究报告不同，不能以综述性讨论代替。

13、写出4G的英文简称、中英文全称，并说明其具体含义。

①GLP：良好药品实验研究规范（Good Laboratory Practices）
含义：该规范从各个方面明确规定了如何严格控制药物研制的质量，以确保实验研究的质量与实验数据的准确可靠。

②GMP：良好药品生产规范（药品生产质量经管规范）（Good Manufacturing Practices）
含义：是药品生产和质量经管的基本准则。

③GCP：良好药品临床实验规范（Good Clinical Practices）
含义：保证药品临床实验资料的科学性、可靠性和重现性。

本规范主要起两个作用：保护志愿受试者和病人的安全和权力；有助于生产厂家申请临床实验和销售许可时能够提供有价值的临床资料。

④GSP：良好药品供应规范（Good Supply Practices）
含义：要求药品供应部门保证药品在运输、贮存和销售过程中的质量和效力，以保护消费者合法权益。

14、分子烙印技术
分子烙印技术(Moleculeimprintingtechnology,MIT),又可称为分子印迹技术,是近年来迅速发展起来的一项新型技术,利用具有分子识别能力的分子烙印聚合物(Moleculeimprintingpolymer , MIP)来分离、筛选、纯化化合物的一种仿生技术.MIP的制备方法是以目标烙印分子为模板,选用能与目标烙印分子产生特定相互作用的功能性单体,在烙印分子周围与交联剂进行聚合,形成三维交联的聚合物网络.通过萃取除去烙印分子,在聚合物网络中形成形态和化学功能团与烙印分子互补的孔穴,其对烙印分子具有特殊的亲合性.
MIT最大的特点就是对模板分子的识别具有可预见性,对于特定物质的分离极具针对性.具有抗恶劣环境能力强、稳定性好、使用寿命长等优点.分子烙印技术日益受到关注,得到了蓬勃的发展,已被应用于手性拆分、仿生传感器、固相萃取、抗体模拟、酶样催化剂以及控释药物等领域的研究.
MIT要经过3个步骤:(1)功能单体和模板分子在一定条件下通过共价或非共价作用形成可逆复合物。

(2)加入交联剂将这种复合物通过交联聚合反应固化,制得高聚物。

(3)将模板分子除去,形成的聚合物即分子烙印聚合物(MIP),MIP依靠分子形状、大小及官能团进行选择性的分子识别。

按照单体与模板分子结合方式的不同,MIT可分为共价型(预组装型)、非共价型(自组装型)及半共价型(牺牲空间法)。

MIP具有构效预定性、特异识别性、广泛实用性三大特点,此外还具有抗恶劣环境能力强、稳定性好、使用寿命长等优点。

这些特点使其在临床药物分析、手性物质的分离等许多领域得到应用。

15、中药指纹图谱
中药含有的活性成分是中药药效的物质基础,任何一种活性成分均不能体现出中医临床用药的整体疗效。

若以个别活性成分的含量作为中药的质量控制指标,而忽略中药的其他成分的作用,则难以确保中药及其制剂的质量。

中药指纹图谱是一种多指标的质量控制模式,虽然它不能代替含量测定,但它比测定任何单一成分所提供的信息却丰富得多,可以比较全面的反映所含化学成分的种类和数量,能够更加有效地体现出中药成分的整体性和综合作用,从而更好地评价中药及其制剂的质量。

中药指纹图谱就是借用了法医学“指纹鉴定”的概念,是指中药经过适当处理后,采用一定的分析手段,得到的能够标示该中药特性的某类或数类成分的色谱或光谱的图谱。

中药指纹图谱作为一种综合的、宏观的、可量化的鉴别手段，能全面的反映中药所含成分的相对关系,是当前符合中药特色的评价中药真实性、稳定性和一致性的质量控制模式。

整体性和模糊性是它的基本属性。

指纹图谱应该反映药材的完整面貌即整体性,但是由于植物药中化学成分天然潜在的不稳定性,所以指纹图谱又具有模糊性。

中药指纹图谱的构建方法：中药指纹图谱的测定方法种类较多,主要采用色谱法分离特征成分,采用紫外光谱(UV) 、红外光谱( IR) 、核磁共振波谱(NMR) 、质谱(MS)等光谱、波谱方法鉴定化合物的结构,现阶段用于构建中药指纹图谱的色谱法主要有:薄层色谱( TLC) 、气相色谱( GC) 、高效液相色谱( HPLC) 、高效毛细管电泳( HPCE) 、高速逆流色谱( HSCCC) ,其中又以HPLC法分离效率高、分析速度快、样品适应性广、检测器种类多、灵敏度高、稳定性强、重复性好而倍受推崇,成为中药指纹图谱的首选方法。

16、高效毛细管电泳
毛细管区带电泳、胶束电动毛细管色谱、毛细管等电聚焦、毛细管凝胶电泳、毛细管等速电泳、毛细管电色谱、阵列毛细管电泳。