抗性淀粉及总淀粉测定方法.

抗性淀粉及总淀粉测定方法

采用Megazyme抗性淀粉试剂盒法，测定方法见试剂盒说明书（下附）

原理（AOAC法2002.02 ;AACC法32-40）

抗性淀粉的测定方法：样品使用α-胰淀粉酶和淀粉葡糖苷酶（AMG）37℃振荡水浴孵育16小时，在这期间，通过两种酶的联合作用，非抗性淀粉被溶解，水解成D-葡萄糖，孵育结束后，加入等体积的乙醇或工业甲基化酒精（IMS,变性乙醇）终止反应。离心上述溶液，收集上清勿弃，底部残留絮状团即为样品中的RS，用含水的IMS或乙醇（50%v/v）洗涤絮状团，洗涤后离心，再重复一次洗涤离心，收集离心后获得的上清，与之前收集的上清混合。小心倒出试管残留的液体，将絮状团置于冰水浴中，加入2M KOH溶解，溶解的同时用磁力搅拌机剧烈搅拌。用醋酸盐缓冲液将这个溶液调至中性，用AMG将淀粉定量水解成葡萄糖。D-葡萄糖用葡糖氧化酶/过氧化物酶试剂（GOPOD）测定，这也是对样品中RS含量的测定。非抗性淀粉（可溶性淀粉）的测定可通过集中的上清液并定容至100mL，再用GOPOD 测定D-葡萄糖完成。

总淀粉测定方法：即抗性淀粉与非抗性淀粉总和。

抗性淀粉检测试剂盒

K-RSTAR

（100次分析）

应用性和精确性

这个方法需要样品中RS含量多于2% w/w。如RS含量多于2% w/w，常规标准误差为±5%。少于2% w/w RS的误差更高。

试剂盒

瓶子1：淀粉葡糖苷酶AMG，12 mL，3300U/ mL，条件为pH4.5，40℃下，底物为可溶性淀粉，[单位或为200U/mL，条件为pH4.5，40℃下，底物为对硝基苯基β-麦芽糖苷]。AMG 溶液应完全没有可检测到的游离D-葡萄糖。4℃下稳定性> 3年。

瓶子2：α-胰淀粉酶(胰酶，10g，3Ceralpha U/mg)。4℃下稳定性> 3年。

瓶子3：GOPOD 试剂缓冲液。磷酸钾缓冲液（1M，pH7.4），对羟基苯甲酸（0.22M）

和叠氮化钠（0.4%W/V）。4℃下稳定性> 3年。

瓶子4：GOPOD试剂酶。葡糖氧化酶（>12,000U）加上过氧化物酶（>650U）和4-氨基安替比林（80mg）。冻干粉，-20℃下稳定性>5年。

瓶子5：D-葡萄糖标准溶液（5 mL,1.0mg/mL）溶于苯甲酸0.2%（w/v）。室温下稳定性>5年。

瓶子6：抗性淀粉对照。抗性淀粉含量如表所示。室温下稳定性>5年。

溶液/悬浮液的制备

1.使用瓶子1中提供的的产品（AMG；溶液1）。这个溶液是有粘性的，因此应使用正向移液器移取分装。4℃下稳定性> 3年。

稀释AMG（300 U/ mL）。取2 mL瓶子1中的AMG浓缩液用0.1M顺丁烯二酸钠缓冲液（0.1M，pH6.0；试剂1，非提供）稀释至22mL。以5 mL为单位分装后用聚丙烯管冷冻保存。反复冻融不会影响稳定性，稳定性-20℃>5年。

用前制备

2.用100mL顺丁烯二酸钠缓冲液(100mM，pH6.0；试剂1，非提供)悬浮1g瓶子2中的产品(α-胰淀粉酶)，搅拌5分钟。加入1.0mL稀释的AMG（300 U/ mL），混匀。>1500g离心10分钟，慢慢倒出上清液，这就是制备的溶液2。溶液2制备后应当天使用。

3.用蒸馏水稀释瓶子3中的产品（GOPOD 试剂缓冲液）稀释至1L，这就是制备的溶液3。制备后马上使用。

备注：

（1）如果浓缩缓冲液在-20℃下储存，它将形成结晶盐，因此必须要完全溶解才可以用蒸馏水稀释。

（2）这个缓冲液包含0.4%（w/v）的叠氮化钠。因此这是个有毒化学物，应进行相应的处理。

4.取瓶3中制备好的溶液320mL溶解瓶子4里全部的产品，定量转移这个溶液至装有剩余溶液3的瓶子中。用铝箔封盖瓶子以遮光。这就是葡萄糖测定试剂（GOPOD 试剂），可以在2-5℃保存3个月或者-20℃下保存一年。

如果试剂要以冷冻态储存，应分装后再冻存。

当试剂是新鲜制备的，它的颜色应是浅黄色或浅粉色。在4℃储存2-3个月时会演变成

深粉色。当以蒸馏水为对照时，这个溶液的吸光度应小于0.05。

5&6.使用瓶子5或6提供的产品。室温下稳定性>5年。

没有提供的试剂（应购买分析纯级）

1.顺丁烯二酸钠（马来酸钠）缓冲液(100mM，pH6.0)加上5mM二水氯化钙和叠氮化钠（0.02%w/v）.

用1600mL蒸馏水溶解23.2g顺丁烯二酸，用4M（160g/L）氢氧化钠调节pH至6.0，加入0.74g二水氯化钙和0.4g叠氮化钠，并溶解。定容至2L。4℃下可保存一年。

2.醋酸钠缓冲液（1.2M，PH

3.8）

将69.6mL的冰醋酸（1.05g/mL）加至800 mL的蒸馏水中，用4M氢氧化钠调节pH至pH3.8。用蒸馏水定容至1L，室温下可保存一年。

3.醋酸钠缓冲液（100mM，PH

4.5）

将5.8mL的冰醋酸加至900 mL的蒸馏水中，用4M氢氧化钠调节pH至4.5。用蒸馏水定容至1L，4℃保存2个月。

4.氢氧化钾溶液（2M）

将112.2gKOH加至900 mL的去离子水中，搅拌溶解。定容至1L，密封保存。室温下可保存2年。

5.含水乙醇（或者IMS）（大约50%v/v）

将500mL乙醇（95%v/v或者99%v/v）或者工业甲基化酒精（IMS；变性乙醇；95% v/v 乙醇加上5%甲醇）至500mL的水中。密封保存，室温下稳定保存>2年。

备注：

一系列包含RS的对照样品0.6%-78%w/w可从Megazyme公司购买。

设备（推荐）

1. 离心式粉碎机，带有齿轮转子和1.0mm筛子，或类似的装置。小型样品可选择旋风磨碎机替代。

2.绞肉机-手动或电动的，装有4.5mm筛。

3.台式离心机-能够放入16×120mm玻璃试管，速度大约1500g(3000rpm)

4.振荡水浴器，可设定为每分钟100次直线运动（振荡速度为每分钟200里程），振荡距离35mm,37℃。