转录后加工

3′-加尾
25-30 bp
ATG TATA box +1 基因的编码序列 终止密码子
mRNA
5′-UTR
3′-UTR
翻译区域
加尾反应由两步组成： 1) 剪切——在3′-UTR一个特定序列上游10-30 核苷 酸序列的位置切开 2) 添加腺苷酸（100-200个）产生多聚腺苷酸尾巴
CPSF
5’ CAP
剪接体的组装与剪接反应（续）
* U6一方面代替U1-snRNP与5'-剪接点的一致序列结合，另 一方面与U4脱离，转而与U2结合； * U6的“脚踩两只船”将分支点上突出的腺苷酸上的2'-OH拉 近到5'-剪接点，为第一次转酯反应创造了条件；在进行 第一次转酯反应以后，紧接着U5-snRNP经历了依赖于 ATP的重排，将相邻的外显子并置在一起，为第二次转 酯反应创造了条件； * 第一次转酯反应中游离出来的外显子上的3'-OH 亲核进攻 5'-剪接点上的磷酸二酯键，导致内含子以套索结构释放 出来并很快被水解，而外显子则被连接起来； * 一旦剪接反应完成，剪接体的所有成分即解体，U6snRNP 与U4-snRNP重新结合参与下一轮剪接反应。
O P O OO
RNA 链
P O
Y
•没有水解，无能量的损失
OO
-
Y
-
剪接的两次转酯反应
参与剪接反应的5种snRNA
snRNA U1 U2 U4 互补性 内含子的5' -端 分支点 U6 snRNA 功能 识别和结合5'-剪接点 识别和结合分支点。在剪接体组装中，也与U6 snRNA 配对。 结合并失活U6。在剪接体组装中，U4-U6之间的碱基配 对被U2-U6之间的剪接配对所取代。U6也取代U1 与5' 剪接点的相互作用。 与相邻的2个外显子结合，以防止它们离开剪接体。 在剪接体中与U2结合。
碱基
5‟ O-P-O-P-OCH2 O O O
O
O
碱基
-
-
磷酸水解酶
Pi
O OH
O
OH
RNA 链
RNA 链
留下的5′-二磷酸进攻GTP，与GMP形成共价交联，同 时释放出PPi.
O O
5‟ O-P-O-P-O-P-OCH2 O O O O
O
O
O
RNA链
-
O
OH
G
mRNA鸟苷酸转移酶
PPi
OH
OH
转录后加工
转录后加工
基因转录的直接产物被称为初级转录物。初 级转录物一般是无功能的，它们在细胞内必 → 须经历一些结构和化学的变化即所谓的转录 后加工以后才会有功能。转录后加工可能是 RNA的功能所必需的，也可能提供基因表达 调控的一种手段。 RNA所能经历的后加工方式可达10种以上， 但后加工反应的本质要么是增减一些核苷酸 序列，要么是修饰某些特定的核苷酸。
尿苷酸的插入

COX II DNA：…GTATAAAA GTAGA G A ACCT GG… COX II RNA：…GUAUAAAAGUAGAUUGUAUACCTGG…
R-环技术:真核基因内含子数目与结构分析
变性
与成熟的mRNA杂交； 在电镜下观察
DNA 模板链 成熟的mRNA
R环实验的结果及其对结果的解释
鸡卵清蛋白基因结构及其Pre-mRNA的后加工
mRNA前体的剪接机制
* mRNA前体的剪接是高度精确的。其精确性一方 面取决于位于外显子和内含子交界处的剪接信号 （可以将其视为内因），另外一方面取决于5种 被称为snRNP的核糖核酸蛋白质复合物（可以将 其视为外因）。 * 剪接反应的“内因”——剪接信号 * 剪接反应的“外因”——snRNP和剪接因子 * 剪接反应——两次转酯反应 * 剪接体的组装
O 5‟ -P-OCH2 O O
Байду номын сангаасOH
OH
5‟ O-P-O-P-OCH2 O O O
碱基
不同寻常的 5′-5′ 三磷酸 连接
G
-
5‟ O-P-O-P-OCH2 O O O
O
O
碱基
-
-
RNA 链
O
OH
鸟嘌呤随后在N7位置被甲基化，甲基供体为S-腺 苷甲硫氨酸
OH OH
5„ m(7)GpppN 帽子
U5 U6
上游外显子 和下游外显子 U4 (和U2)
snRNP的重要性
小分子核核糖核酸蛋白颗粒（发音为 snurps）—— 参与剪接 一种 snRNP 由一个小分子细胞核RNA（snRNA） (100-200核苷酸长）和10种不同的蛋白质组成 snRNPs和mRNA前体形成剪接体 剪接体大小与核糖体差不多，其组装需要ATP
剪接体的组装和去组装
在招募U4/U6-U5 snRNP 时发生的RNA相互作用
在U1 和 U4离开剪接体以 后发生的RNA相互作用
分支点腺苷酸2„ –羟基的突出以及5‟ –剪接点和3„ –剪接点的结构
真核细胞剪接体的装配示意图
次要剪接途径
* GU-AG规则适合绝大多数断裂基因，以此为剪接信号的 剪接途径被称为主要剪接途径。但近几年来，已发现某 些断裂基因的某些内含子的剪接信号并不遵守GU-AG规 则，例如，人PCNA基因的第6个内含子、人软骨基质蛋 白的第7个内含子、Rep-3的第6个内含子和果蝇的一种同 源异形盒转录因子的内含子均以AT开头，AC结尾。除此 以外，这一类内含子在5'-剪接点和分支点上具有高度保 守的序列，分别是ATATCCTY和TCCTTRAY。含有与这 两段保守序列互补序列的U11和U12-snRNAs参与AT-AC 内含子的剪接，另外两种snRNAs即U4atac和U6atac分别 代替U4和U6参与这种剪接途径，只有U5被证明同时参与 主要剪接途径和次要剪接途径。
~ 10 种不同的 蛋白质
•小 (100-200个核苷酸)
•富含 U •U1, U2, U4, U5, U6 snRNAs
U1, U2, U4, U5, U6 snRNPs
剪接体的组装与剪接反应
* 分支点结合蛋白（BBP）识别分支点并与它结合，剪 接因子U2AF与富含嘧啶的序列结合； * U2-snRNP取代BBP，并与分支点的一致序列配对。 然而，U2-snRNA与分支点一致序列之间的配对并不 完美，在分支点内唯独有一个A无互补配对的U，因 此，这个“孤零零”的A就突出在双螺旋外而被激活， 为剪接的第一次转酯反应提供了便利； * U1-snRNP 与5'-剪接点的一致序列互补配对； * U4/U6 -U5-snRNP三聚体进入剪接体。
SnRNAs
*一般由60nt~300nt组成，且富含U * 对于剪接十分重要
* 调节序列的特异性和剪接反应的精确性
* 折叠成特定的二级结构，这对催化十分重要
*snRNP中起催化作用的是RNA，不是蛋白质
*参与剪接的只有U1、U2、U4、U5和U6
剪接体
5 snRNPs (“snurps”)
snRNA
为什么只有mRNA被snRNPs剪接？
* RNA聚合酶的CTD是剪接必需的 * 剪接体内的剪接因子与CTD作用 * 这保证来自RNA聚合酶II的转录物处于和剪 接机构正确的相互作用的位置。
选择性剪接和反式剪接
选择性剪接 剪接是精确的，但是... * 一种mRNA前体可以通过去除不同的内含子/外 显子组合而剪接成两种以上的mRNA，从而导 致一个基因可以编码多种蛋白质 * 选择性剪接受到调节 * 果蝇的性别决定与选择性剪接有关 反式剪接 * 发生在两个mRNA分子之间的剪接 * 比较罕见 * 自然界只发现在锥体虫和秀丽线虫
为什么只有mRNA加帽?
* 之所以只有mRNA和某些snRNA才有帽子结 构，是因为它们都由聚合酶II催化，当 TFIIH磷酸化CTD重复序列中的Ser5以后， 它即可以将转录因子DSIF 招募到转录复合 物，而新加入到复合物之中，DSIF随后将另 外一种转录因子NELF招募进来，以阻滞转 录。上述暂停允许加帽酶进入，来修饰转录 物的5'-端。第三种转录因子P-TEFb是一种 激酶，在帽子结构形成不久也被招募到复合 物，然后磷酸化CTD的Ser2和NELF，NELF 随之失活，聚合酶II继续延伸。
加帽和甲基化
* 帽子结构和类型 0、I和 II型 * 加帽反应：共转录 1) 酶 磷酸水解酶；mRNA鸟苷酸转移酶；鸟嘌呤-7-甲基转移 酶 2) 步骤 * 为什么只有mRNA才会加帽？ * 功能
加帽反应
开始于mRNA 5′-三磷酸的 γ 磷酸根的水解
g
O
b a
O O
5‟ O-P-O-P-O-P-OCH2 O O O O
AAAAAAAAAAAAA100-200
加尾信号
为什么必须有尾巴？
保护mRNA免受3′-外切核酸酶的消化，提高 mRNA的稳定性。 PABP能够与帽子相互作用增强mRNA的可翻 译性，提高其翻译的效率； 影响最后一个内含子的剪接； 某些本来缺乏终止密码子的mRNA通过加尾 反应创造终止密码子。在UG后加尾可产生 UGA，在UA后加尾产生UAA； 通过选择性加尾调节基因的表达。
原核细胞mRNA前体的后加工
在细菌，mRNA很少有后加工。但某些噬菌体 mRNA会发生最简单的剪切反应，将一个多顺 反子切割成单顺反子，也有某些噬菌体的 mRNA需要经过相对复杂的剪接反应才能成熟 （如T4噬菌体编码的胸苷酸合酶）。
真核细胞mRNA前体的后加工
* 加工形式 1) 5′-端 = 加帽 2) 3′-端 = 加尾 3) 内部 = 剪接 4) 内部=甲基化 5) 编码区=编辑 * 后加工机制
为什么只有mRNA才会加尾？
* 与加帽反应一样，只有mRNA才会加 尾，也是因为聚合酶 II 最大亚基上的 CTD 重复序列被 TFIIH 磷酸化，但是 磷酸化位点为 Ser2 。 Ser2 的磷酸化将 加尾因子招募到mRNA 前体上进行加 尾反应。
mRNA前体的剪接
剪接这种后加工方式是在发现基因断裂的现象后确定 的。1977年，由Phillip Sharp和Richard Roberts领导两个 实验小组几乎同时在腺病毒的晚期表达基因中发现蛋 白质基因断裂现象。 进一步研究表明，基因断裂是真核细胞及其病毒的基 因组中的普遍现象，在高等生物的基因组中，只有很 少的蛋白质基因是连续的（如组蛋白和干扰素），但 在低等的真核生物，断裂基因却不多见。 不同断裂基因含有的内含子数目不一定相同，同样内 含子大小也会有差别。一般说来，一个典型的真核生 物蛋白质的基因由10% 的外显子序列和90%的内含子 序列组成。
O O
甲基转移酶
CH3
RNA 链
O
O
G
RNA链
-P-OCH 2 O O
O
OH
-
OH
OH
-P-OCH2 O O O
O-P-O-P-OCH2 O O O
碱基
-
G
O
O
O-P-O-P-OCH2 O O O
碱基
-
OH
可能 的甲 基化 修饰
0型帽子 1型帽子
2型帽子
为什么要有帽子？
提高mRNA的稳定性 参与识别起始密码子的过程，提高mRNA的可翻 译性 有助于mRNA通过核孔从细胞核运输到细胞质 提高剪接反应的效率。
CFI CFII
PAP
AAUAAA
mRNA
核糖核酸蛋白复合物
1) CPSF = “剪切/多聚腺苷酸化特异性因子（3个亚基） 识别mRNA前体 3′-UTR上的 AAUAAA 一致序列，并与 此结合。 2) 招募CFI和CFII = “剪切因子” 3) 招募PAP = “poly(A)聚合酶”
CPSF
剪接信号
1. 5′-剪接点 GU
内含子
2. 3′-剪接点 AG G 3′外显子 18 - 40 个核 苷酸
5′外显子AG
Y= 嘧啶
R= 嘌呤 N = 任何核苷酸
YNYRAY
3. 分支点
剪接通过2次转酯反应
* 在转酯反应中，1个磷酸二酯键被转移到另外1个羟 基上。
X
O
R + R - OH X - OH +
加帽
加尾
反式剪接
mRNA前体的编辑
* 定义 任何发生在转录后编码区内的序列变化 * 主要类型 1) 尿苷酸的插入 2) C→U (哺乳动物的Apo B-48) 3) A→I (哺乳动物谷氨酸受体的一个亚基) * 机制 1) gRNA 2) 特殊的脱氨酶 * 意义 1) 提高遗传信息的容量 2) 创造终止密码子和起始密码子
5’ 帽子
CFI CFII
PAP
AAUAAA
mRNA
* mRNA前体在AAUAAA序列下游10-30个核苷酸的位 置被CFI/II切开 * 产生的3′-OH被PAP作为添加腺苷酸的位点。PAP不 需要模板，只对ATP有亲和性 * Poly(A)尾巴被 poly(A)-结合蛋白结合（PABP）
AAUAAA