生物选修三-基因工程

基因工程

一. DNA连接酶和DNA聚合酶的比较：

!）成分：蛋白质

2）作用部位：催化形成磷酸二脂键（即核甘酸与核甘酸之间）

3）作用过程：DNA聚合酶：将单个脱氧核昔酸连接成DNA长链

DNA连接酶：将DNA片段的末端（粘性和平末端）

4）作用结果：DNA连接酶：将存在的DNA片段连接成重组DNA , 不需要模板

DNA聚合酶：以一条DNA链为模板，形成新的DNA 分子二. DNA重组的基本工具：

1）限制性核酸内切酶：简称限制酶。主要是从原核细胞中纯化出来

的。能够特异性识别双链DNA分子的某种特定序列（如：EcoR I识别GAATTC序列，切出粘性末端。Sma I特异性识别CCCGGG序列，切出平末端）并且能使每一条链的特定部位的两个脱氧核甘酸之间的磷酸二酯键断开，大多数限制酶识别序列由6个核昔酸组成。

2）DNA连接酶：根据酶的来源不同，把酶分为两类：一种是大肠杆菌分离出的E'coliDNA连接酶（恢复粘性末端），另一种是从T4噬菌体分离出的T4DNA连接酶（既可以连接平末端又可以连接粘性末端，连接平末端的效率较低）

3）载体：质粒是常用的载体，质粒是一种裸露的，结构简单，独立于细菌拟核之外，并具有白我复制能力的很小的双链环状DNA分子。质粒的DNA分

子上有很多限制酶切割位点，供外源DNA插入其中。质粒DNA分子上有独特的标记基因（如：四环素抗性基因，氨节青霉素抗性基因等，供重组DNA 的鉴定和选择）

在基因工程中使用的运载体除质粒外，还有入噬菌体的衍生物，动植物病毒等。

三，基因工程的基本操作程序：

1）获取目的基因：目的基因即编码蛋白质的基因（人工合成法：以目的基因转录成的mRNA为模版合成双链DNA的方法和根据已知的蛋白质的氨基酸序列推测出相应结构基因的核昔酸序列和从白然界已有的物种中分离出来）

§基因文库：将含有某种生物的不同基因的许多DN#段，导入受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同的基因。M1. 包含一种生物所有的基因的基因文库叫做基因组文库。M2.只包含了一种生物的的一部分基因，这种基因文库叫部分基因文库。M 3通过用某种生物发育的某个时期的mRN 辰转录所产生的DNA

§可以根据基因的核昔酸序列，基因的功能，基因在染色体上的位置，基因转录的mRNA以及基因的表达产物蛋白质等特性获取目的基因

2）构建表达载体：基因工程的核心

1. 目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一* 代，同时，使目的基因能够表达和发挥作用

M2组成：启动子（一段特殊的DN研段，位于基因的首端，它是RNA 聚合酶识别和结合的部位，有它才能转录出mRNA最终获得所需要的蛋白质）终止子（一段特殊的DNAt段，位于基因的末端，使转录在所需要的地方停止下来）标记基因（为了鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而使含有目的基因的细胞筛选出来）3.将目的基因导入受体细胞：

§目的基因导入受体细胞，并在受体细胞内维持稳定和表达的过程，叫做转化

§将目的基因导入植物细胞：

M1.农杆菌转化法：农杆菌在白然条件下感染双子叶植物和裸子植物

（当植物受伤时，伤口处的细胞会分泌大量的酚类化合物，吸引农杆菌移向这些细胞，这时农杆菌中的Ti质粒上的T-DNA（可转移DNA）转移到受体细胞，并整合到受体细胞的染色体的DNA上，这种方法比较经济有效）M 2.基因枪法（将包裹在金属颗粒表面的DNA打入受体细胞中，使基因与其整合。）版3.花粉管通道法（在植物授粉后，花粉形成的花粉管还未愈合前，减去柱头，然后滴加含目的基因的DNA ,使目的基因借助花粉管通道进入受体细胞。是一种简单经济的方法）

§将目的基因导入动物细胞

显微注射法：转基因动物中采用的最多，也是最有效的一种将目的基因导入动物细胞的方法（将含有目的基因的表达载体提纯，使DNA 浓度保持在1 —3微克、毫升，然后从雌性动物体内取出卵【可在体内受精，也可在体外受精】采用显微注射仪进行显微注射，再将注射了目的基因的受精卵，经胚

胎早期培养一段时间再移植到雌性动物的输卵管或子宫内）

§将目的基因导入微生物细胞

M1.原核细胞的特点：繁殖快，多为单细胞，遗传物质较少等，早期的基因工程都用原核生物做受体细胞。

M 2.大肠杆菌细胞最常用的转化方法：首先用钙离子处理细胞，使细胞处于一种能吸收周围环境DNA分子的生理状态（即感受态，处于这个状态的细胞叫感受态细胞）再在一定温度下促进感受态细胞吸收DNA分子，完成转化过程。

4.目的基因的检测与鉴定

§目的基因导入受体细胞后，是否可以稳定维持和表达其遗传特性，

只有通过鉴定才知道。

M1.检测DNA是否插入了目的基因：采用DNA分子杂交技术，即将转基因生物的基因组DNA提取出来，在含有目的基因的DNA片段上用放射性同位素等标记，以此作为探针，使探针与基因组DNA

杂交，如果显示杂交带，就表明DNA已经插入到染色体中

M2,检测目的基因是否转录出了RNA，从转基因生物中提取RNA, 用标记的目的基因做探针，与mRNA杂交，显示杂交带，则目的基因转录出了mRNA

M3,检测基因是否翻译成了蛋白质，从转基因生物体内提取出蛋白

质，用相应的抗体做抗体--抗原杂交，若有杂交带出现，表明目的基因已经

形成了蛋白质产品

M4,有时要做个体生物学水平的鉴定。

三，基因工程的应用实例

1, 转基因植物

§杀虫基因：Bt毒蛋白基因，蛋白酶抑制剂基因，淀粉酶抑制剂基

因，植物凝集素基因

§抗病基因：^Nb 1.抗病毒:病毒外侨蛋白基因，病毒的复制酶基因

M 2,抗真菌：几丁质酶基因，抗毒素合成基因

§抗逆基因：渗透压调节基因【抗盐碱】，抗冻蛋白基因【抗冻】，抗除草剂基因【抗除草剂】

§转基因改良植物的品质

2, 转基因动物

§用于提局生长速度

§用于改善畜产品的品质（肠乳糖酶基因导入奶牛基因组，使乳糖含量降低）

§用转基因动物生产药物【将药用蛋白基因和乳腺蛋白基因的启动子

等调控组件重组在一起，通过显微注射等方法，导入哺乳动物的受精卵中，使其发育成转基因动物，进入分泌期后可以通过分泌乳汁来生产所需要的药物，因而称作乳房（乳腺）生物反应器，如抗血凝酶, 血清白蛋白，生长激素，a -抗胰蛋白酶】