动物细胞培养基础知识
合集下载
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
化学：重金属盐、氧化剂、表面活性剂
生物：抗生素
三、动物细胞培养用液
培养基 平衡盐 其他（杂用液）
（一）、培养基
1、组成成分
糖：葡萄糖 无机离子与微量元素 ：如铁、锌、硒、铜、锰、
钼、钒
氨基酸：12种必需氨基酸，精氨酸、胱氨酸、异亮氨
酸、亮氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、色 氨酸、组氨酸、酪氨酸和缬氨酸。Ｌ型。
组织培养技术建立的早期，体外培养细胞都是利用天然培养基。 天然培养基含有丰富的营养物质，渗透压、pH等也与体内环境
相似，但制作过程复杂、批间差异大，因此逐渐为合成培养基所 替代。
目前仍然广泛使用的天然培养基是血清（serum），另外组织提 取液、促进细胞贴壁的胶原类物质在培养某些特殊细胞时也不可 缺少。
理化性质： 如渗透压、 pH ，球蛋白、血红蛋白含量 越低血清质量越高。
微生物检测：包括细菌、真菌、支原体、病毒等 促生长效果检测：克隆形成率测定法和连续传代培养测
定法。
（一）、培养基
（1）、天然培养基
血清的使用与储存： 大部分血清在使用之前必须经过灭活处理，即56℃放置
30分钟。（灭活的目的是去除血清中的补体成分，避免补体对
无血清培养基：基础培养液 + 添加组分。
（一）、培养基
（2）、合成培养基 ②无血清培养基 添加组分包括以下几大类物质：
促贴壁物质：一般是细胞外基质，如纤连蛋白（FN）、层粘连 蛋白(LN)等。
促生长因子及激素 酶抑制剂 ：最常用的是大豆胰酶抑制剂。 结合蛋白和转运蛋白：常见的有转铁蛋白和牛血清白蛋白。
使用过的玻璃器皿 立即浸入水中待洗
一般玻璃仪器：肥皂水/洗涤剂洗涤 蒸馏水洗涤2~3次 量器：铬酸洗液浸泡4~6小时 蒸馏水洗涤2~3次
二、常用器具的清洗消毒方法
1、清洗
（2）橡胶器材 初次使用：0.5mol/L NaOH 15min 0.5mol/L
HCl 15min 自来水煮沸 蒸馏水煮沸20min
主要内容
实验室设置 常用器具的清洗消毒方法 动物细胞培养用液
一、实验室设置
基本实验室：准备室+接种室+培养室
辅助实验室：细胞学实验室+生化分析室
二、常用器具的清洗消毒方法
1、清洗
（1）玻璃器材： 初次使用的玻璃器皿：洗涤剂/肥皂水洗涤
1~5%HCl浸泡过夜 蒸馏水洗2~3次
细胞产生细胞毒作用。灭活也会损失一些对细胞有利的成分如生 长因子，因此也有人提出血清不经灭活直接用于培养 ）
储存条件 ： 血清一般储存于-20℃，同时应避免反复冻融。可灭
活后分装，使用时4℃融化。
（一）、培养基
（1）、天然培养基 血清使用的缺点：批次差异。 鼠尾胶原：它的主要作用是促进细胞的贴壁，
造成培养基 pH 波动的主要物质是细胞代谢产生 的CO2,在封闭式培养过程中CO2与水结合产生碳 酸，培养基pH 很快下降。
（一）、培养基
2、pH：
调节：使用NaHCO3-CO2缓冲系统（合成培养基中， 或Hepes ），再通过稳定调节培养箱中CO2 气体的浓
度（5%）,使之与培养基中的NaHCO3 处于平衡状态。
用过的橡胶制品：同玻璃器材的清洗
二、常用器具的清洗消毒方法
1、清洗
（3）塑料器皿
2%NaOH浸泡过夜 2~5% HCl 浸泡 30min 蒸馏水洗
（4）金属器皿
洗衣粉洗涤 蒸馏水洗
酒精棉球擦拭晾干
二、常用器具的清洗消毒方法
2、消毒 物理：热力灭菌 、电离辐射、紫外灭菌
NaHCO3 ＋H2O ←→ Na++HO-+H2O+CO2 ↑
当[CO2]能够保持相对稳定时，上述反应就可达到平衡， [OH－]也相对恒定，即pH 相对恒定 。
（一）、培养基
3、分类
天然培养基
合成培养基
（一）、培养基
（1）、天然培养基源自文库
天然培养基：主要指来自动物体液或利用组织分离提取的一类培 养基，如血浆、血清、淋巴液、鸡胚浸出液等。
（一）、培养基
1、组成成分：
维生素：至少8种，生物素、叶酸、烟酰胺、泛酸、 吡哆醇、核黄素、硫胺素、维生素Ｂ12。
促生长因子及激素：如胰岛素（insulin），它能促 进细胞利用葡萄糖和氨基酸。
（一）、培养基
2、pH：
大多数细胞的适宜 pH为7.2～7.4, 一般不能超过 6.8~7.6。
（一）、培养基
（1）、天然培养基
血清的种类 ：主要是牛血清，在培养某些特殊细胞 时也用人血清、马血清等。
牛血清还分为小牛血清、新生牛血清和胎牛血清。 一般使用的为小牛血清，小牛血清取自出生10～30 天的小牛。
（一）、培养基
（1）、天然培养基 血清的质量标准 ：血清质量的鉴定一般包括
这类合成培养基称为“基本培养基”或“通用培养基”，在添加 了一定比例的血清之后，称之为“完全培养基”。
（一）、培养基
（2）、合成培养基
①基本培养基：常用基本培养基 199培养基 低限量基础培养基（minimum essential media,MEM） DMEM(Dulbecco’s modified Eagle medium) IMDM(Iscove’s modified Dulbecco’s medium)：适合于细胞
特别是对上皮类细胞。 组织浸出液： Hank’s浸30min
（一）、培养基
（2）、合成培养基 基本培养基 无血清培养基 无蛋白培养基
（一）、培养基
（2）、合成培养基
①基本培养基：
最初研制合成培养基，就希望使其完全替代天然培养基，但结果 却没有象人们所预期的那样，许多合成培养基都只能使体外培养 细胞短暂生存，只有在添加了少量天然培养基（血清）之后，细 胞才能在其中长期生长繁殖。
密度较低、生长较困难的情况
RPMI1640
（一）、培养基
（2）、合成培养基
②无血清培养基
虽然基础培养基加少量血清所配制的完全培养基可以满足大 部分细胞培养实验的要求，但对有些实验却不适合，如观察 一种生长因子对某种细胞的作用，又如测定某种细胞在培养 过程中分泌某种物质（抗体、生长因子）的能力。
生物：抗生素
三、动物细胞培养用液
培养基 平衡盐 其他（杂用液）
（一）、培养基
1、组成成分
糖：葡萄糖 无机离子与微量元素 ：如铁、锌、硒、铜、锰、
钼、钒
氨基酸：12种必需氨基酸，精氨酸、胱氨酸、异亮氨
酸、亮氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、色 氨酸、组氨酸、酪氨酸和缬氨酸。Ｌ型。
组织培养技术建立的早期，体外培养细胞都是利用天然培养基。 天然培养基含有丰富的营养物质，渗透压、pH等也与体内环境
相似，但制作过程复杂、批间差异大，因此逐渐为合成培养基所 替代。
目前仍然广泛使用的天然培养基是血清（serum），另外组织提 取液、促进细胞贴壁的胶原类物质在培养某些特殊细胞时也不可 缺少。
理化性质： 如渗透压、 pH ，球蛋白、血红蛋白含量 越低血清质量越高。
微生物检测：包括细菌、真菌、支原体、病毒等 促生长效果检测：克隆形成率测定法和连续传代培养测
定法。
（一）、培养基
（1）、天然培养基
血清的使用与储存： 大部分血清在使用之前必须经过灭活处理，即56℃放置
30分钟。（灭活的目的是去除血清中的补体成分，避免补体对
无血清培养基：基础培养液 + 添加组分。
（一）、培养基
（2）、合成培养基 ②无血清培养基 添加组分包括以下几大类物质：
促贴壁物质：一般是细胞外基质，如纤连蛋白（FN）、层粘连 蛋白(LN)等。
促生长因子及激素 酶抑制剂 ：最常用的是大豆胰酶抑制剂。 结合蛋白和转运蛋白：常见的有转铁蛋白和牛血清白蛋白。
使用过的玻璃器皿 立即浸入水中待洗
一般玻璃仪器：肥皂水/洗涤剂洗涤 蒸馏水洗涤2~3次 量器：铬酸洗液浸泡4~6小时 蒸馏水洗涤2~3次
二、常用器具的清洗消毒方法
1、清洗
（2）橡胶器材 初次使用：0.5mol/L NaOH 15min 0.5mol/L
HCl 15min 自来水煮沸 蒸馏水煮沸20min
主要内容
实验室设置 常用器具的清洗消毒方法 动物细胞培养用液
一、实验室设置
基本实验室：准备室+接种室+培养室
辅助实验室：细胞学实验室+生化分析室
二、常用器具的清洗消毒方法
1、清洗
（1）玻璃器材： 初次使用的玻璃器皿：洗涤剂/肥皂水洗涤
1~5%HCl浸泡过夜 蒸馏水洗2~3次
细胞产生细胞毒作用。灭活也会损失一些对细胞有利的成分如生 长因子，因此也有人提出血清不经灭活直接用于培养 ）
储存条件 ： 血清一般储存于-20℃，同时应避免反复冻融。可灭
活后分装，使用时4℃融化。
（一）、培养基
（1）、天然培养基 血清使用的缺点：批次差异。 鼠尾胶原：它的主要作用是促进细胞的贴壁，
造成培养基 pH 波动的主要物质是细胞代谢产生 的CO2,在封闭式培养过程中CO2与水结合产生碳 酸，培养基pH 很快下降。
（一）、培养基
2、pH：
调节：使用NaHCO3-CO2缓冲系统（合成培养基中， 或Hepes ），再通过稳定调节培养箱中CO2 气体的浓
度（5%）,使之与培养基中的NaHCO3 处于平衡状态。
用过的橡胶制品：同玻璃器材的清洗
二、常用器具的清洗消毒方法
1、清洗
（3）塑料器皿
2%NaOH浸泡过夜 2~5% HCl 浸泡 30min 蒸馏水洗
（4）金属器皿
洗衣粉洗涤 蒸馏水洗
酒精棉球擦拭晾干
二、常用器具的清洗消毒方法
2、消毒 物理：热力灭菌 、电离辐射、紫外灭菌
NaHCO3 ＋H2O ←→ Na++HO-+H2O+CO2 ↑
当[CO2]能够保持相对稳定时，上述反应就可达到平衡， [OH－]也相对恒定，即pH 相对恒定 。
（一）、培养基
3、分类
天然培养基
合成培养基
（一）、培养基
（1）、天然培养基源自文库
天然培养基：主要指来自动物体液或利用组织分离提取的一类培 养基，如血浆、血清、淋巴液、鸡胚浸出液等。
（一）、培养基
1、组成成分：
维生素：至少8种，生物素、叶酸、烟酰胺、泛酸、 吡哆醇、核黄素、硫胺素、维生素Ｂ12。
促生长因子及激素：如胰岛素（insulin），它能促 进细胞利用葡萄糖和氨基酸。
（一）、培养基
2、pH：
大多数细胞的适宜 pH为7.2～7.4, 一般不能超过 6.8~7.6。
（一）、培养基
（1）、天然培养基
血清的种类 ：主要是牛血清，在培养某些特殊细胞 时也用人血清、马血清等。
牛血清还分为小牛血清、新生牛血清和胎牛血清。 一般使用的为小牛血清，小牛血清取自出生10～30 天的小牛。
（一）、培养基
（1）、天然培养基 血清的质量标准 ：血清质量的鉴定一般包括
这类合成培养基称为“基本培养基”或“通用培养基”，在添加 了一定比例的血清之后，称之为“完全培养基”。
（一）、培养基
（2）、合成培养基
①基本培养基：常用基本培养基 199培养基 低限量基础培养基（minimum essential media,MEM） DMEM(Dulbecco’s modified Eagle medium) IMDM(Iscove’s modified Dulbecco’s medium)：适合于细胞
特别是对上皮类细胞。 组织浸出液： Hank’s浸30min
（一）、培养基
（2）、合成培养基 基本培养基 无血清培养基 无蛋白培养基
（一）、培养基
（2）、合成培养基
①基本培养基：
最初研制合成培养基，就希望使其完全替代天然培养基，但结果 却没有象人们所预期的那样，许多合成培养基都只能使体外培养 细胞短暂生存，只有在添加了少量天然培养基（血清）之后，细 胞才能在其中长期生长繁殖。
密度较低、生长较困难的情况
RPMI1640
（一）、培养基
（2）、合成培养基
②无血清培养基
虽然基础培养基加少量血清所配制的完全培养基可以满足大 部分细胞培养实验的要求，但对有些实验却不适合，如观察 一种生长因子对某种细胞的作用，又如测定某种细胞在培养 过程中分泌某种物质（抗体、生长因子）的能力。