动物细胞培养常用方法

一.细胞增殖周期（cell proliferatinal cycle）概念细胞周期是描述细胞增殖和分化交替发生变化的概念。

而细胞增殖周期主要是从细胞增殖角度赋予细胞活动的概念，两者不应混为一谈。

细胞增殖周期是指细胞从一次分裂结束开始生长，到下一次分裂结束所经历的过程。

根据细胞增殖周期不同时期的生化特点，划分为四个连续的时期，即G1期（DNA合成前期），S期（DNA合成期），G2期（DNA合成后期），M期（有丝分裂期）。

如以G1期为起点，那么细胞增殖周期的各时期应循着G1-S-G2-M的顺序进行，G1、S、G2三期合称为细胞间期，此期完成细胞生长过程。

M期完成遗传物质的分配。

因此，细胞增殖周期=间期（G1期+S期+G2期）+分裂期（M期）。

二.培养细胞生命期（life span of culture cells）很多细胞特别是正常细胞，在体外的生存不是无限的，而是具有一个生命期。

索维培养细胞生命期，是指细胞在培养中持续增殖和生长的时间。

培养细胞的生命期与细胞的种类、性状和原供体的年龄、健康等情况有关。

人胚二倍体成纤维细胞，在不冻存和反复传代条件下，科传30~50代，相当于150~300个细胞增殖周期，能维持1年左右的生存时间，最后衰老凋亡。

如供体为成体或衰老个体，则生存时间较短；其他细胞如肝细胞或肾细胞，生存时间更短，仅能传几代或十几代。

只有当细胞发生遗传性改变，如获永生性或恶性转化时，细胞的生存期才可能发生改变。

正常细胞培养时，不论细胞的种类和供体的年龄如何，在细胞生命的全过程中，大致都经历以下三个阶段：原代培养期、传代期、衰退期。

三.培养细胞一代生存期培养细胞的生存空间和营养是有限的，当细胞增殖达到一定密度后，则需要分离出一部分细胞和更新营养液，否则将影响细胞的继续生存，这一过程叫传代（Passage或Subculture）。

每次传代以后，细胞的生长和增殖过程都会受一定的影响。

传代的频率或间隔与培养液的性质、接种细胞的数量和细胞增殖的速度等有关。

接种细胞数量大，细胞基数大。

相同增殖速度条件下，细胞数量增加与饱和速度相对要快（实际上细胞接种数量大时细胞增殖速度比稀少时要快）；连续细胞系和肿瘤细胞系比初代培养细胞增值快；；培养液中血清含量多时细胞增殖比少时快。

以上情况都会缩短传代时间。

所谓细胞“一代”一词，仅指从细胞接种到分离培养时的一段时间，这已成为培养工作中的一种习惯说法，它与细胞时代或倍增非同意含义。

如某一细胞系为第20代细胞，即指该细胞系已传代20次。

在细胞一代中，细胞能倍增3~6次。

细胞传一代后，一般要经过以下六个阶段：游离期、贴壁期、潜伏期、指数增长期、停滞期、衰退期。

四.无菌操作要求（一）实验前培养室和超净台的消毒。

在工作台面消毒时，切勿将培养细胞和培养用液用紫外线照射；工作台面上的用品不要过多或重叠放置，否则会遮挡射线，降低消毒效果；一些操作用具，如移液器、废液缸、污物盒、试管架等用75%酒精擦拭后置台内同时紫外线照射消毒。

（二）无菌操作工作区域应保持清洁与宽敞，必要物品，如试管架、移液器或吸管头等可以暂时放置，其他实验用品用完后应及时移出，以利气体流通。

试剂瓶口和外壁要用75％酒精擦拭后才能带人无菌操作台内。

超净台上的物品布局要合理，污物废液缸、酒精棉球缸在右侧位，酒精灯在中央区，试剂瓶在左侧位。

实验操作应在操作台中央无菌区域内进行，勿在边缘非无菌区域操作。

（三）洗手和着装：严格按照外科手术要求消毒着装，双手用肥皂洗净后，浸泡于消毒液中，并用75％的酒精擦拭。

（四）操作中，小心取出无菌实验用品，避免造成污染。

尽量减少手与器材的接触面，学会手指操作。

手指不能触及器材使用端及容器瓶口，如触及，需要更换或烧灼后再使用。

组织、细胞及培养板在未做处理和使用前，不要过早暴露于空气中。

（五）一切操作，如打开或封闭瓶口，安装吸管、注射器等，都要在酒精灯火焰前方进行。

瓶口、吸管、注射器等使用前要经过火焰烧灼后使用。

但要注意，金属器械不能在火焰中长时间烧灼，以防退火c另外，胶塞、橡皮乳头及塑料制品等细胞培养用品过火焰时也不能时间太长，以免烧焦产生有毒气体，危害细胞。

（六）试剂瓶顺风斜放在支架上，培养瓶、培养液瓶不要过早打开。

容器打开后，用手夹住瓶盖并握住瓶身，倾斜约45°角取用，尽量避免垂直放置以防止下落细菌的污染。

吸取液体前，瓶口和吸管应行火焰消毒，吸取液体时避免瓶口和吸管碰撞。

吸管不能混用，吸过培养液的吸管不能再烧灼，因残留在吸管内的培养液成分如蛋白质等烧焦后会产生有害物质，吸管再用时会将其带到培养基中。

不要在打开的容器正上方操作。

瓶口液滴不能倒回瓶内，液滴用于酒精棉球擦拭，瓶口再经火焰消毒。

（七）不同的细胞同时操作时，要专管专用，并要勤换吸管，防止扩大污染和细胞交叉污染。

（八）操作者动作要准确敏捷，尽量避免空气流动。

不要面向操作台讲话或咳嗽，避免唾沫将微生物带人超净台内，污染空气。

同时应注意自身的安全，对于来自人源性或病毒感染的细胞株应特别小心，并选择适当等级的无菌操作台(至少两级)。

操作过程中小心有毒性试剂，例如DMSO及TPA等。

实验者离开超净台时，立即用肘关节关闭侧窗口，避免无茵室内细菌随空气流人净化操作区。

五.高压蒸汽灭菌装置（一）使用方法1.首先将内层灭菌桶取出，再向外层锅内加入适量的水，使水面与三角搁架相平为宜。

2.放回灭菌桶，并装入待灭菌物品。

注意不要装得太挤，以免妨碍蒸汽流通而影响灭菌效果。

三角烧瓶与试管口端均不要与桶壁接触，以免冷凝水淋湿包口的纸而透入棉塞。

3.加盖，并将盖上的排气软管插入内层灭菌桶的排气槽内。

再以两两对称的方式同时旋紧相对的两个螺栓，使螺栓松紧一致，勿使漏气。

4.通电加热，并同时打开排气阀，使水沸腾以排除锅内的冷空气。

待冷空气完全排尽后，关上排气阀，让锅内的温度随蒸汽压力增加而逐渐上升。

当锅内压力升到所需压力时，控制热源，维持压力至所需时间。

5.到达灭菌所需时间到后，切断电源，让灭菌锅内温度自然下降，当压力表的压力降至0时，打开排气阀，旋松螺栓，打开盖子，取出灭菌物品。

如果压力未降到0时，打开排气阀，就会因锅内压力突然下降而发生意外事故。

（二）注意事项1.消毒过程中，操作者不能离开工作岗位，要定时检查压力及安全，防止意外事件发生。

消毒完毕后从压力蒸汽消毒器中取出的消毒好的物品(不包括液体)，应立即放到60℃~70℃烤箱内烘干，再贮存备用，否则，潮湿的包装物品表面容易被微生物污染。

但如果消毒物中有液体时，一定要待消毒器冷却后方可打开消毒器的盖，不能先打开阀门放气，否则液体会溢出。

2.不同压力蒸汽所达到的温度不同，不同消毒物品所需的有效消毒压力和时间不同。

平衡盐溶液及其他需要灭菌的液体：121℃，10磅(68.95kPa)，20min；布类、玻璃制品、金属器械等物品：121℃，15磅(103.42kPa)、20min。

六.使用血清的注意事项血清的质量、种类及使用的浓度都有可能影响细胞的生长，而不同批次的血清支持细胞生长的能力也不同，尤其是对克隆细胞的牛长，某些批次血清可能含有毒性或抑制细胞生长的物质。

因此，在购买大量血清之前，必须对血清支持细胞生长能力进行检测，包括接种率、生长曲线、维持细胞特性、无生物污染性等方面，然后再大量购买质量好的同一批号的血清，并注意以下几点：（一）需要长期保存的血清必须储存于-20℃或-70℃低温冰箱中，同时应避免反复冻融。

4℃冰箱中保存时间切勿超过1个月。

由于血清结冰时体积会增加约10％，因此，血清在冻入低温冰箱前必须预留一定的体积空间，否则易发生污染或玻璃瓶冻裂。

（二）一般厂商提供的血清为无菌，无需再过滤除菌。

如发现血清有悬浮物，则可将血清加入培养液内一起过滤，切勿直接过滤血清。

（三）瓶装血清解冻需采用逐步解冻法：-20℃或-70℃低温冰箱中的血清放人4℃冰箱中溶解1d，然后移入室温，待全部溶解后再分装。

在溶解过程中需不断轻轻摇晃均匀(小心勿造成气泡)，使温度与成分均一，减少沉淀的发生。

切勿直接将血清从-20℃或-70℃直接放人37℃解冻，这样因温度改变太大，容易造成蛋白质凝集而出现沉淀。

（四）热灭活是指56℃，30min加热已完全解冻的血清。

加热过程中需规律摇晃均匀。

此热处理的目的是使血清中的补体成分灭活。

除非必须，一般不建议作此热处理，因为热处理会造成血清沉淀物显著增多，而且还会产生其他不明效应。

究竟灭活与否，以有利于实验为主。

切勿将血清在37℃放置太久，否则血清会变得浑浊，黏度增大，同时血清中的有效成分会被破坏而影响血清质量。

（五）血清中的絮状物主要是血清中的脂蛋白变性及解冻后血清中的纤维蛋白造成，这些絮状物不会影响血清本身的质量。

可3000r/min，离心5min去除，也可不用处理。

（六）采购血清时，最好先从供应商处索取样品进行试验，选定一批后就要保留足够使用6个月至1年的量，直至用到另一批经过预先试验的样品代替。

七.基本培养基的应用基本培养基只能维持细胞的生存，想要使细胞生长和增殖，还需补充部分天然培养基和一些补充成分，效果才更好。

主要是牛血清、谷氨酰胺等。

此外，为防止污染，还经常加一定的抗菌素。

补加了上述物质的培养基叫完全培养基。

按其血清量的多少又分为生长液和维持液。

由于培养液是细胞赖以生存的环境，制备过程要操作严格，避免混入杂质。

使用的成分应精心选择，必须用质量最优的试剂，容器要仔细清洗和消毒。

八.合成培养基的保存（一）液体培养基的保存：液体培养基应于4℃冰箱避光保存，实验前放入37℃预热。

液体培养基中的L-谷氨酰胺会随着储存时间的延长而慢慢分解。

如果细胞生长不良，可以再添加适量L-谷氨酰胺。

液体培养基经冷冻后再经溶化时，其溶液的PH值会发生改变，溶液往往变碱，某些成分溶解也会对细胞生长不利。

故液体培养基一定要存放在冷藏箱中，通常液体培养基在冷藏条件下可存放6个月至一年。

（二）干粉培养基的保存：4℃冰箱避光保存，有效期36个月。

九.平衡盐溶液（Balanced Salt Solution，BSS）平衡盐溶液是细胞培养中常用的基本液体。

它主要是由无机盐、葡萄糖组成，其作用是维持细胞渗透压平衡，保持pH稳定及提供简单的营养。

主要用于合成培养基的基础液、取材时组织块的漂洗、细胞的漂洗、配置其他试剂等，最简单的BSS是Ringer。

平衡盐溶液的种类很多，常用的几种见表。

各种平衡盐溶液的主要区别在于氯化钠的浓度、离子的浓度及缓冲系统不同，可根据需要选用适当的个衡盐溶液。

最常用的BSS是D-Hank’s、Hank’s、Earle液。

D-Hank’s和Hank’s的一个主要区别是前者不含有Ca2+、Mg2+，因此D-Hank’s常用于配制胰酶溶液。

Hank’s和Earle液的主要区别是缓冲能力个同，Earle液含会高浓度的NaHCO3（2.2g/L），缓冲能力较强，适合于5%C02的培养条件，在空气水平的C02中，，溶液会变碱，Hank’s液仅含有0.35g/L NaHCO3，缓冲能力较弱，不能用于5%C02的环境，若放入C02培养箱，溶液将迅速变酸．使用时应注意。