动物细胞培养常用方法

一.细胞增殖周期（cell proliferatinal cycle）概念

细胞周期是描述细胞增殖和分化交替发生变化的概念。而细胞增殖周期主要是从细胞增殖角度赋予细胞活动的概念，两者不应混为一谈。细胞增殖周期是指细胞从一次分裂结束开始生长，到下一次分裂结束所经历的过程。根据细胞增殖周期不同时期的生化特点，划分为四个连续的时期，即G1期（DNA合成前期），S期（DNA合成期），G2期（DNA合成后期），M期（有丝分裂期）。如以G1期为起点，那么细胞增殖周期的各时期应循着G1-S-G2-M的顺序进行，G1、S、G2三期合称为细胞间期，此期完成细胞生长过程。M期完成遗传物质的分配。

因此，细胞增殖周期=间期（G1期+S期+G2期）+分裂期（M期）。

二.培养细胞生命期（life span of culture cells）

很多细胞特别是正常细胞，在体外的生存不是无限的，而是具有一个生命期。索维培养细胞生命期，是指细胞在培养中持续增殖和生长的时间。培养细胞的生命期与细胞的种类、性状和原供体的年龄、健康等情况有关。人胚二倍体成纤维细胞，在不冻存和反复传代条件下，科传30~50代，相当于150~300个细胞

增殖周期，能维持1年左右的生存时间，最后衰老凋亡。如供体为成体或衰老个体，则生存时间较短；其他细胞如肝细胞或肾细胞，生存时间更短，仅能传几代或十几代。只有当细胞发生遗传性改变，如获永生性或恶性转化时，细胞的生存期才可能发生改变。正常细胞培养时，不论细胞的种类和供体的年龄如何，在细胞生命的全过程中，大致都经历以下三个阶段：原代培养期、传代期、衰退期。

三.培养细胞一代生存期

培养细胞的生存空间和营养是有限的，当细胞增殖达到一定密度后，则需要分离出一部分细胞和更新营养液，否则将影响细胞的继续生存，这一过程叫传代（Passage或Subculture）。每次传代以后，细胞的生长和增殖过程都会受一定的影响。传代的频率或间隔与培养液的性质、接种细胞的数量和细胞增殖的速度等有关。接种细胞数量大，细胞基数大。相同增殖速度条件下，细胞数量增加与饱和速度相对要快（实际上细胞接种数量大时细胞增殖速度比稀少时要快）；连续细胞系和肿瘤细胞系比初代培养细胞增值快；；培养液中血清含量多时细胞增殖比少时快。以上情况都会缩短传代时间。

所谓细胞“一代”一词，仅指从细胞接种到分离培养时的一段时间，这已成

为培养工作中的一种习惯说法，它与细胞时代或倍增非同意含义。如某一细胞系为第20代细胞，即指该细胞系已传代20次。在细胞一代中，细胞能倍增3~6次。细胞传一代后，一般要经过以下六个阶段：游离期、贴壁期、潜伏期、指数增长期、停滞期、衰退期。

四.无菌操作要求

（一）实验前培养室和超净台的消毒。在工作台面消毒时，切勿将培养细胞和培养用液用紫外线照射；工作台面上的用品不要过多或重叠放置，否则会遮挡射线，降低消毒效果；一些操作用具，如移液器、废液缸、污物盒、试管架等用75%酒精擦拭后置台内同时紫外线照射消毒。

（二）无菌操作工作区域应保持清洁与宽敞，必要物品，如试管架、移液器或吸管头等可以暂时放置，其他实验用品用完后应及时移出，以利气体流通。试剂瓶口和外壁要用75％酒精擦拭后才能带人无菌操作台内。超净台上的物品布局要合理，污物废液缸、酒精棉球缸在右侧位，酒精灯在中央区，试剂瓶在左侧位。实验操作应在操作台中央无菌区域内进行，勿在边缘非无菌区域操作。（三）洗手和着装：严格按照外科手术要求消毒着装，双手用肥皂洗净后，浸泡于消毒液中，并用75％的酒精擦拭。

（四）操作中，小心取出无菌实验用品，避免造成污染。尽量减少手与器材的接触面，学会手指操作。手指不能触及器材使用端及容器瓶口，如触及，需要更换或烧灼后再使用。组织、细胞及培养板在未做处理和使用前，不要过早暴露于空气中。

（五）一切操作，如打开或封闭瓶口，安装吸管、注射器等，都要在酒精灯火焰前方进行。瓶口、吸管、注射器等使用前要经过火焰烧灼后使用。但要注意，

金属器械不能在火焰中长时间烧灼，以防退火c另外，胶塞、橡皮乳头及塑料制品等细胞培养用品过火焰时也不能时间太长，以免烧焦产生有毒气体，危害细胞。（六）试剂瓶顺风斜放在支架上，培养瓶、培养液瓶不要过早打开。容器打开后，用手夹住瓶盖并握住瓶身，倾斜约45°角取用，尽量避免垂直放置以防止下落细菌的污染。吸取液体前，瓶口和吸管应行火焰消毒，吸取液体时避免瓶口和吸管碰撞。吸管不能混用，吸过培养液的吸管不能再烧灼，因残留在吸管内的培养液成分如蛋白质等烧焦后会产生有害物质，吸管再用时会将其带到培养基中。不要在打开的容器正上方操作。瓶口液滴不能倒回瓶内，液滴用于酒精棉球擦拭，瓶口再经火焰消毒。

（七）不同的细胞同时操作时，要专管专用，并要勤换吸管，防止扩大污染和细胞交叉污染。

（八）操作者动作要准确敏捷，尽量避免空气流动。不要面向操作台讲话或咳嗽，避免唾沫将微生物带人超净台内，污染空气。同时应注意自身的安全，对于来自人源性或病毒感染的细胞株应特别小心，并选择适当等级的无菌操作台(至少两级)。操作过程中小心有毒性试剂，例如DMSO及TPA等。实验者离开超净台时，立即用肘关节关闭侧窗口，避免无茵室内细菌随空气流人净化操作区。

五.高压蒸汽灭菌装置

（一）使用方法

1.首先将内层灭菌桶取出，再向外层锅内加入适量的水，使水面与三角搁架相平为宜。

2.放回灭菌桶，并装入待灭菌物品。注意不要装得太挤，以免妨碍蒸汽流通而影响灭菌效果。三角烧瓶与试管口端均不要与桶壁接触，以免冷凝水淋湿包口的

纸而透入棉塞。

3.加盖，并将盖上的排气软管插入内层灭菌桶的排气槽内。再以两两对称的方式同时旋紧相对的两个螺栓，使螺栓松紧一致，勿使漏气。

4.通电加热，并同时打开排气阀，使水沸腾以排除锅内的冷空气。待冷空气完全排尽后，关上排气阀，让锅内的温度随蒸汽压力增加而逐渐上升。当锅内压力升到所需压力时，控制热源，维持压力至所需时间。

5.到达灭菌所需时间到后，切断电源，让灭菌锅内温度自然下降，当压力表的压力降至0时，打开排气阀，旋松螺栓，打开盖子，取出灭菌物品。如果压力未降到0时，打开排气阀，就会因锅内压力突然下降而发生意外事故。

（二）注意事项

1.消毒过程中，操作者不能离开工作岗位，要定时检查压力及安全，防止意外事件发生。消毒完毕后从压力蒸汽消毒器中取出的消毒好的物品(不包括液体)，应立即放到60℃~70℃烤箱内烘干，再贮存备用，否则，潮湿的包装物品表面容易被微生物污染。但如果消毒物中有液体时，一定要待消毒器冷却后方可打开消毒器的盖，不能先打开阀门放气，否则液体会溢出。

2.不同压力蒸汽所达到的温度不同，不同消毒物品所需的有效消毒压力和时间不同。平衡盐溶液及其他需要灭菌的液体：121℃，10磅(68.95kPa)，20min；布类、玻璃制品、金属器械等物品：121℃，15磅(10

3.42kPa)、20min。六.使用血清的注意事项

血清的质量、种类及使用的浓度都有可能影响细胞的生长，而不同批次的血清支持细胞生长的能力也不同，尤其是对克隆细胞的牛长，某些批次血清可能含有毒性或抑制细胞生长的物质。因此，在购买大量血清之前，必须对血清支持细