流式细胞术

• 凋亡： • 由于凋亡细胞核酸内切酶活化， DNA 降 解 ， 细 胞 DNA 减 少 ， 因 而 可 在 G0/G1 峰前出现一个亚二倍体峰，也就 是凋亡峰。检测调亡，可进行抗肿瘤药 物研究和某些因素对细胞的损伤机理的 研究。
2 细胞表型分析：
• 细胞表型的分析得益于单克隆抗体的 产生及发展，现在CD系统已有247种之多。 细胞用带有荧光的单克隆抗体标记后，用 流式细胞仪可对其进行检测分析，可分析 出荧光细胞的含量，也可分析出这种阳性 细胞的CD分子的相对含量。标记的方法一 般用直标法，也可用间标法。荧光探针多 为FITC、PE、PE-CY5、PerCP、CY5、 APC等。
四、 流式细胞术的应用
1 细胞DNA含量检测：
细胞固定后用PI染色，因为PI特 异性结合于细胞DNA，荧光强度与PI 的结合量呈良好的线性关系，根据这 个原理，并通过专用的DNA分析软件， 可测出细胞的DNA含量。用于细胞周 期、细胞倍体以及凋亡的检测。
• 肿瘤诊断： • DNA 异倍体的出现是癌变的一个重 要标志，细胞的增殖能力的大小也可反 映肿瘤的生物学特征。因此，临床上可 利用流式细胞仪进行细胞周期分析和 DNA 倍性分析，辅助肿瘤诊断，包括监 测癌前病变、肿瘤的早期诊断、交界性 肿瘤诊断和肿瘤细胞学诊断等各方面。
应用 血小板无力症诊断： CD41/CD61缺失或异常 巨大血小板综合征诊断： CD42a/CD42b缺失 免疫性血小板减少性紫癜诊断： PAIgG 血栓前状态与血栓性疾病诊断： 血小板活化异常
4 红细胞疾病诊断
网织红细胞计数与应用 • 网织红细胞是未完全成熟的红细胞，胞浆中 仍残留有不同含量的 RNA 。 RNA 含量越高，网织 红细胞越幼稚，反之，则接近于成熟红细胞。网 织红细胞是反映骨髓红系造血的指针。用荧光染 料噻唑橙(Thiazole Orange，TO)可使活体网织红 细胞中 RNA 染色，用 488nm 激光激发后发射绿色 荧光， FCM 分析其荧光强度的大小可测量网织红 细胞的数量和RNA含量。主要用于贫血筛查。 • 睡眠性血红蛋白尿症(PNH)的诊断 • 红细胞表面CD59缺失
细胞系的鉴定
• 新建细胞系
• 新建立的细胞系，进行系列的表型分 析，以确定此细胞系的表型。 对于已知细胞系，由于多次传代和培 养条件的改变，细胞遗传信息可能会发生 突变，对其进行表型分析，以检测该细胞 系是否有变异。
• 已有细胞系的表型分析•源自3 血小板功能分析与血小板病诊断
原理 血小板是由骨髓巨核细胞产生的无 核细胞，正常静止状态呈两面微凸的圆盘 状，平均直径2～3μm。活化的血小板呈不 规则形状，表面有大量星状突起，彼此间 常发生粘附、聚集。血小板膜上有丰富的 糖蛋白受体，是血小板发挥功能的分子基 础。
• 一、 流式细胞术的概念 流式细胞术（FCM）就是对在高速 流动的鞘液包括下的细胞、粒子进行分 析和分选的技术，这种细胞或粒子是经 过特异荧光标记的。其特点是测量速度 快，每秒钟能测数千个乃至上万个细胞， 且可进行多参数测量，另一特点是在分 析的同时可把具有指定特征的细胞分离 出来，这就是分选技术。
三、 流式细胞仪可检测到的细胞参数
1 前向角散射（FSC）：前向角散射 光的强度与细胞的大小有关，也就是说， 同一个细胞群体， FSC 强的，其细胞大 一些，而FSC弱的，其细胞小一些。 2 侧向角散射（SSC）：侧向角散射 又称 90°散射或大角散射。侧向角散射 光对细胞膜、胞质、核膜的折射率更为 敏感，对胞内较大的颗粒也会有反应。 所以，侧向角散射光的强弱可反应细胞 内精细结构和颗粒的性质。
• ⒉抗体的选择： • 一定要选择商业化的流式用单 克隆抗体，此类抗体在制备过程中 有严格的质控，非特异荧光弱。最 好用直标抗体，如果是用间标抗体， 二抗的选择更应严格。
㈡样品的准备
• 评价一个样品制备的优劣，可 有三个评价指标，即①细胞的密度， 不能低于1×106/ml ； ②非特异荧 光，不超过1％；③细胞碎片和聚集 体，不能出现肉眼可见的团块。
淋巴细胞分类： • CD3(T 细 胞 ， CD4 、 CD8)) 、 CD19 （ B 细胞）、 CD16 、 CD56 （ NK 细胞）， 原发性或继发性免疫缺陷病、自身免疫性 疾病、淋巴细胞增殖病、肿瘤疗效观察与 预后判断、移植免疫检测等。
造血干/祖细胞计数 • 造血干/祖细胞存在于骨髓和外周血 中，形态与淋巴细胞相似，用普通形态 学方法难以识别。由于造血干 /祖细胞表 面可表达 CD34 和 CD45 抗原且具有很高 的核酸含量，因而用 CD34 和 CD45 单克 隆抗体和核酸染料进行三色荧光标记， FCM 多参数分析血液、骨髓和浓缩白细 胞悬液中造血干 /祖细胞的数量，对临床 血液病、恶性肿瘤、基因异常等疾病的 造血干 /祖细胞移植治疗有十分重要的意 义。
6 可溶性蛋白的检测：
为最新发展起来的用于检测可溶性蛋 白的流式细胞技术(CBA)，是将待检蛋白吸 附到微球上，再与荧光探针结合，测定微 球上这种蛋白的荧光强度，与已知微球的 荧光强度相比较，求出待测蛋白的含量， 分析软件可自动给出相关方程。
7 分选：
• 用荧光探针标记的细胞，可被有效地 分离出来，可用于分选的效率较高的仪器 国内较少，台式机一般分选速度为每少钟 300个细胞，而大型机分选速度可达到每秒 上万个细胞，并可做到点对点分选。但分 选速度也与细胞中目的细胞的百分率及细 胞悬液的密度有关。
在细胞生长状态良好时测试、避 免反复吹打 彻底消化、在用酒精固定细胞时 加入终浓度为1.5-3％的小牛血 清 改用生物素-亲和素、增加抗体 用量、延长反应时间 改用原位末端标记或Annexin-V 和PI双标记法
荧光弱 测不出亚二倍 体峰
㈢样品对照 • 细胞的荧光有自发荧光、非特异荧 光和特异荧光，并且流式细胞术提供的 阳性细胞百分比和荧光强度都是相对阴 性细胞而言的，所以在样品制备中样品 对照的设臵至关重要。①在测 DNA 时， 要设正常细胞对照，即不做任何干预的 细胞对照。②在检测细胞膜CD分子和细 胞内蛋白或细胞因子时，要设同型抗体 对照，如果是双标记或三标记检测，还 要设单标记的阳性对照。
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静止与活化血小板膜糖蛋白分子的 种类、含量、结构、功能等显著不同， 一些血小板糖蛋白的分子缺陷常导致血 小板止血功能的异常，某些糖蛋白分子 在血小板膜上高表达又是血小板被活化 的特异性分子标志。当血小板表面结合 有自身抗体时常导致血小板减少。血小 板的上述变化，通过用荧光素标记的单 克隆抗体结合流式细胞术，可以敏感、 特异、快速的诊断血小板病。
5 细胞内蛋白的分析：
• 细胞破膜后将细胞内某一蛋白成分进行荧 光标记，用流式细胞仪进行测量分析，同表型 分析一样，可以测量出这种阳性细胞的数量和 这种蛋白的相对含量。并且，结合细胞表型分 析，进行多标记和多参数分析，可以检测出含 这种蛋白的细胞是属于哪一种表型的细胞。多 用间标法，荧光探针多为FITC。也可以与周期 分析结合起来，分别分析蛋白阳性和蛋白阴性 细胞的细胞周期，这在研究功能蛋白对周期的 调控作用是非常有用的工具。
肿瘤预后估计： 异倍体肿瘤恶性度、复发率、转移 率和死亡率都较二倍体肿瘤高。已有文献 报道，在乳腺、结肠、直肠、前列腺和膀 胱肿瘤中，异倍体和较高的S期百分比都 是不良预后的标志。同样的，在肺癌、头 预部肿瘤、卵巢癌、肾癌、子宫内膜癌、 黑色素瘤和白血病中，亦有类似发现。因 此在病理组织学分级、临床分期等指标基 础上，用流式细胞仪检测肿瘤 DNA 倍体 能更客观地预测预后。
3 荧光强度（FL）：是细胞或细胞上 的荧光染料被激光激发后发射出的荧光， 不同的荧光染料其发射波长不同。通过荧 光强度可将同一个细胞群体中的有荧光标 记的细胞与无荧光标记的细胞区分开来， 也就是我们通常所说的阳性细胞，也可以 将阳性细胞中的高FL的细胞与低FL的细胞 区分开来，也就是可以把强阳性细胞和弱 阳性细胞区分开来。一般的流式细胞仪只 装有一个激光光源（488nm），可测出三 个FL，即FL1、FL2、FL3，大型的流式细 胞仪装有两个或三个激光光源（488nm、 633nm和325nm），可测出6个FL。
白血病的免疫分型 流式细胞术白血病免疫分型是利用荧光素 标记的单克隆抗体作分子探针，多参数分析白 血病细胞的细胞膜和细胞浆或细胞核的免疫表 型，由此了解被测白血病细胞所属细胞系列及 其分化程度。FCM分析白血病免疫表型时，测 量细胞数一般在 10000 ～ 50000 细胞之间，而 且快速、特异、准确，重复性好，能区分细胞 起源、划分其分化发育阶段等，对白血病的诊 断与分型、治疗方案选择与预后判断、发病机 理研究等有重要价值。
流式样品制备过程中常见的问题及解决对策
常见问题
细胞密度低 非特异荧光强 碎片多 细胞聚集
原
因
解决对策
增加离心时间、吸弃上清
选择纯度高的抗体、用同型对照抗 体或双标记排除非特异荧光
制备过程中细胞损失 抗体不纯、死亡细胞多 细胞死亡、机械损伤 消化不完全、酒精固定 造成的细胞粘连 灵敏度不够、抗体加入 量不饱和、反应时间短 凋亡测试方法选择不当
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血小板检测指标： 质膜糖蛋白：CD41/CD61（gpⅡb/Ⅲa）、 CD42b(GPⅠb/Ⅸ/Ⅴ) 颗粒膜糖蛋白：CD62P、CD63、TSP。 活化：gpⅡb/Ⅲa复合物—活化早期标志物 CD62P—活化后期的表面标志 血小板抗体（PAIgG）。 网织血小板计数：常用染料为TO。
而现代流式细胞术，更是由于结合 了单克隆抗体技术、定量细胞化学和定 量荧光细胞化学的应用，使其在生物学、 临床医学、药物学等众多研究领域的应 用将会越来越广泛。
五、流式样品的制备中应注意的几个问题
• ㈠荧光素和抗体的选择 • ⒈荧光素的选择 ： 现在国内引进的大多数流式 细胞仪只装有一个激光光源，即 488nm 光源，所 以我们在选择荧光素时要选择能被 488nm 激光激 发的荧光素，常用的荧光素有： • ①测细胞DNA和RNA含量：PI、7-AAD。 • ②测细胞蛋白、抗体或抗原：FITC、PE、Per-CP、 PE-CY5、PerCP-CY5.5。 • ③测细胞膜电位：Rho-123。 • ④测钙离子：Fluo-3。
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流式细胞仪对一个样品提供的结果是否可 信，虽然与仪器操作者的水平有很大关系，但 在很大程度上取决于样品制备的优劣。细胞密 度太低，影响测试速度并造成测试参数调整的 困难，尤其是在做DNA分析时，由于细胞太少， 势必要提高样品的流速，人为地增大了 G0/G1 期的 CV 值，影响了结果的可靠性；非特异荧 光强，则造成样品结果的假阳性；聚集体增多， 尤其是肉眼可见的细胞聚集体，可造成流式细 胞仪进样针的阻塞，影响仪器的性能，碎片可 干扰测试结果，造成结果分析的困难。
二、流式细胞仪的工作原理 待测细胞被制成单个细胞的悬液，经特异 性荧光染料染色后放入样品管中，在清洁气体的 压力下进入流动室。流动室内充满鞘液，鞘液的 作用有二：一是约束样品使之在喷嘴中心以提高 测量精度；二是防止样品靠近喷孔壁以避免堵塞 喷孔。在这种约束作用下，细胞排成单列一个跟 随一个地在鞘液包括下由流动室下面的喷嘴中心 喷出，形成细胞液柱。液柱与入射的高度聚焦的 激光束相交，此时，细胞上的荧光染料被激发而 产生特异性荧光。在与入射激光和液柱都垂直的 方向设臵有荧光测量系统，包括透镜、光阑、滤 片、检测器等，将细胞的荧光信号变成电信号输 出到计算机，用专用软件进行分析。
FCM的应用，概括成一句话就是 凡是能被荧光素标记的且这种荧光素 能被流式细胞仪所配臵的激光光源激发的 细胞或颗粒，都可用流式细胞仪检测。 在 生物检测技术中流式细胞仪是不可多得的 一机多用的仪器。
纵观历史，几乎没有哪一门科学技术 象流式细胞术这样凝结了众多不同学术背 景、不同科研领域的科学家的心血。从流 式细胞术的发明、改进，流式细胞仪的研 制、革新，到今天的众多应用领域的拓展， 每一步都是诸如生物学、生物技术、计算 机科学、电子工程学、流体力学、激光技 术、高等数学、临床医学、分子生物学、 有机化学和物理学等学科知识综合运用的 结晶。