聚丙烯酰胺凝胶电泳原理步骤详细
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AP在水溶液中能产生游离基SO42-.，使丙烯 酰胺单体的双键打开，活化形成自由基丙 烯酰胺，然后游离Acr和Bis作用就能聚合 形成凝胶
TEMED的游离碱基能促进AP形成SO42-.
注意： TEMED量多少都会影响催化作用，须在碱性条
件下聚合 分子氧存在，聚合不完全，须去除分子氧，隔绝
氧 升高温度能提高聚合，降低温度能延迟聚合
Acr + Bis----- porous matrix
.
❖ （1）丙烯酰胺（acrylamide，Acr）结构式
.
（2）亚甲双丙烯酰胺
（N，N，N’，N’-methylene bisacrylamide，Bis）
.
.
讲课内容
1
PAG的组成
2
PAG的聚合
3
PAG的浓度与孔径的关系
4
不连续PAGE
.
交联度C——Bis占单体与交联剂总量的百分比。 C=b/（a+b）×100% 当T固定时，Bis浓度在5%时孔径最小。
.
讲课内容
1
PAG的组成
2
PAG的聚合
3
PAG的浓度与孔径的关系
4
不连续PAGE
5
PAGE的特点
.
四、不 连 续 PAGE (Discontinuous PAGE)
按具体操作分 垂直板形电泳 圆盘电泳
化学聚合法聚合成小孔胶
.
分离原理
1. 浓缩效应 1）凝胶层的不连续性
两层凝胶T与C不同孔径不同 浓缩胶孔径大，分离胶孔径小，蛋白质在大孔 径浓缩胶中移动，受阻力小，移动速度快。
.
2）缓冲液离子成分的不连续性 甘氨酸（pI=6.0）在pH8.3带负电，朝正极
移动，进入浓缩胶（pH6.7），甘氨酸解 离度（）很小，有效迁移率（M ）很低， 移动速度较慢，称为慢离子。 HCl 是强电解质，=1，Cl-有效迁移率大， 移动速度快，称快离子。 蛋白质（pI＜6.0）带负电荷，有效迁移率介 于两者之间。
.
（二）光聚合：核黄素-TEMED系统
有痕迹氧存在下，核黄素（riboflavin）在光照 下（可见光或紫外光）分解，其黄素部分被还原成 无色型，但在有氧条件下无色型又被氧化成带有游 离基的黄素，其也能使Acr和Bis聚合形成凝胶。 注意：
分离胶的合成一般采用化学聚合。因为若用光聚 合，凝胶的孔径受光照强度与时间的影响，导致孔 径大小不同，从而影响蛋白质的分离。
PAG孔径的大小主要由Acr和Bis这两种物质的浓 度决定。可以根据要分离物质分子的大小，选择合 适的单体浓度。 Acr/Bis：20~40 完全透明且有弹性
＜10 很脆，易碎，不透明 ＞100 糊状不成形，易破碎
.
凝胶总浓度T——100ml凝胶溶液中含有Acr和 Bis的总克数。
T=（a+b）/m×100% T越大，凝胶孔径越小，适用于分离分子量较小 的物质。 T越小，凝胶孔径越大，适用于分离分子量较大 的物质。
.
讲课内容
1
PAG的组成
2
PAG的聚合
3
wk.baidu.com
PAG的浓度与孔径的关系
4
不连续PAGE
5
PAGE的特点
.
一、PAG 的 组成
PAG 是 由 丙 烯 酰 胺 （ acrylamide，Acr） 单 体 和 N，N’- 亚 甲 双 丙 烯 酰 胺 （ N，N，N’，N’methylene bisacrylamide，Bis）交联剂通过自 由基（ free radicals）聚合而成的一种多孔三维网 状结构。
按凝胶系统的均匀性分 continuous PAGE discontinuous PAGE
.
Schematic of discontinous electrophoresis technique
.
Disc-PAGE
电极槽缓冲液通常为pH8.3 Tris-甘氨酸缓冲液
成分
作用
样品 T=3% C=20%单体
胶
欲分离的样品溶液
pH6.7 Tris-HCl缓冲液
混在一起，用光聚合方法聚 合而成的大孔凝胶
有防对流作用
.
Disc-PAGE
成分
作用
浓 缩 除不加样品外，其余组成成 样品在此胶中
胶 分同样品胶相同
被浓缩
.
Disc-PAGE
成分
作用
分离 T=7%C=2.5% 单 体 溶 主要的电泳分
胶液
离部分
pH8.9 Tris-HCl缓冲液
各蛋白质所带电荷不同、分子大小不同而分 离
.
.
.
Load a sample into a polyacrylamide gel electrophoresis well
5
PAGE的特点
.
二、PAG的聚合 polymerization of PAG
需要催化剂(catalyzer)——氧化还原系 统作用，使Acr单体带有游离基(Free radicals )，从而与Bis进行聚合
.
（一）化学聚合：AP-TEMED系统
过硫酸胺 [(NH4)2S2O8] （Ammonium persulfate，AP）作为 催化剂，四甲基乙二胺 （-N,N,N',N'tetramethylethylene diamine , TEMED）为 加速剂。
.
讲课内容
1
PAG的组成
2
PAG的聚合
3
PAG的浓度与孔径的关系
4
不连续PAGE
5
PAGE的特点
.
三、PAG的浓度与孔径的关系
the initial concentrations of acrylamide and BIS control the hardness and degree of crosslinking of the gel.
.
pH8.3 Tris-Glycine buffer
样品
样品胶 浓缩胶
分离胶
甘氨酸 蛋白质 HCl
区低 电 导
.
3）pH值的不连续性 为了控制慢离子的解离度，从而控制其有
效迁移率，必须使浓缩胶与分离胶之间pH值 有所区别。
.
3.分子筛效应与电荷效应 进入分离胶后，Gly-成为快离子 分离胶只有电荷效应和分子筛效应，根据
聚丙烯酰胺凝胶电泳
Polyacrylamide Gel Electrophoresis ，
P李A莉GE
1
.
小
结
1.掌握（不连续）PAGE的原理 2.掌握影响PAGE迁移率的因素 3.掌握PAGE的操作注意点、试剂作用 4.熟悉PAG的聚合
.
思考题
名词解释 1.凝胶总浓度 2.交联度 问答题 1.与CAME相比，PAGE有哪些特点。 2.试比较CAME与PAGE操作的区别。 3.简述不连续PAGE的原理。
AP在水溶液中能产生游离基SO42-.，使丙烯 酰胺单体的双键打开，活化形成自由基丙 烯酰胺，然后游离Acr和Bis作用就能聚合 形成凝胶
TEMED的游离碱基能促进AP形成SO42-.
注意： TEMED量多少都会影响催化作用，须在碱性条
件下聚合 分子氧存在，聚合不完全，须去除分子氧，隔绝
氧 升高温度能提高聚合，降低温度能延迟聚合
Acr + Bis----- porous matrix
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❖ （1）丙烯酰胺（acrylamide，Acr）结构式
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（2）亚甲双丙烯酰胺
（N，N，N’，N’-methylene bisacrylamide，Bis）
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讲课内容
1
PAG的组成
2
PAG的聚合
3
PAG的浓度与孔径的关系
4
不连续PAGE
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交联度C——Bis占单体与交联剂总量的百分比。 C=b/（a+b）×100% 当T固定时，Bis浓度在5%时孔径最小。
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讲课内容
1
PAG的组成
2
PAG的聚合
3
PAG的浓度与孔径的关系
4
不连续PAGE
5
PAGE的特点
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四、不 连 续 PAGE (Discontinuous PAGE)
按具体操作分 垂直板形电泳 圆盘电泳
化学聚合法聚合成小孔胶
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分离原理
1. 浓缩效应 1）凝胶层的不连续性
两层凝胶T与C不同孔径不同 浓缩胶孔径大，分离胶孔径小，蛋白质在大孔 径浓缩胶中移动，受阻力小，移动速度快。
.
2）缓冲液离子成分的不连续性 甘氨酸（pI=6.0）在pH8.3带负电，朝正极
移动，进入浓缩胶（pH6.7），甘氨酸解 离度（）很小，有效迁移率（M ）很低， 移动速度较慢，称为慢离子。 HCl 是强电解质，=1，Cl-有效迁移率大， 移动速度快，称快离子。 蛋白质（pI＜6.0）带负电荷，有效迁移率介 于两者之间。
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（二）光聚合：核黄素-TEMED系统
有痕迹氧存在下，核黄素（riboflavin）在光照 下（可见光或紫外光）分解，其黄素部分被还原成 无色型，但在有氧条件下无色型又被氧化成带有游 离基的黄素，其也能使Acr和Bis聚合形成凝胶。 注意：
分离胶的合成一般采用化学聚合。因为若用光聚 合，凝胶的孔径受光照强度与时间的影响，导致孔 径大小不同，从而影响蛋白质的分离。
PAG孔径的大小主要由Acr和Bis这两种物质的浓 度决定。可以根据要分离物质分子的大小，选择合 适的单体浓度。 Acr/Bis：20~40 完全透明且有弹性
＜10 很脆，易碎，不透明 ＞100 糊状不成形，易破碎
.
凝胶总浓度T——100ml凝胶溶液中含有Acr和 Bis的总克数。
T=（a+b）/m×100% T越大，凝胶孔径越小，适用于分离分子量较小 的物质。 T越小，凝胶孔径越大，适用于分离分子量较大 的物质。
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讲课内容
1
PAG的组成
2
PAG的聚合
3
wk.baidu.com
PAG的浓度与孔径的关系
4
不连续PAGE
5
PAGE的特点
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一、PAG 的 组成
PAG 是 由 丙 烯 酰 胺 （ acrylamide，Acr） 单 体 和 N，N’- 亚 甲 双 丙 烯 酰 胺 （ N，N，N’，N’methylene bisacrylamide，Bis）交联剂通过自 由基（ free radicals）聚合而成的一种多孔三维网 状结构。
按凝胶系统的均匀性分 continuous PAGE discontinuous PAGE
.
Schematic of discontinous electrophoresis technique
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Disc-PAGE
电极槽缓冲液通常为pH8.3 Tris-甘氨酸缓冲液
成分
作用
样品 T=3% C=20%单体
胶
欲分离的样品溶液
pH6.7 Tris-HCl缓冲液
混在一起，用光聚合方法聚 合而成的大孔凝胶
有防对流作用
.
Disc-PAGE
成分
作用
浓 缩 除不加样品外，其余组成成 样品在此胶中
胶 分同样品胶相同
被浓缩
.
Disc-PAGE
成分
作用
分离 T=7%C=2.5% 单 体 溶 主要的电泳分
胶液
离部分
pH8.9 Tris-HCl缓冲液
各蛋白质所带电荷不同、分子大小不同而分 离
.
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Load a sample into a polyacrylamide gel electrophoresis well
5
PAGE的特点
.
二、PAG的聚合 polymerization of PAG
需要催化剂(catalyzer)——氧化还原系 统作用，使Acr单体带有游离基(Free radicals )，从而与Bis进行聚合
.
（一）化学聚合：AP-TEMED系统
过硫酸胺 [(NH4)2S2O8] （Ammonium persulfate，AP）作为 催化剂，四甲基乙二胺 （-N,N,N',N'tetramethylethylene diamine , TEMED）为 加速剂。
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讲课内容
1
PAG的组成
2
PAG的聚合
3
PAG的浓度与孔径的关系
4
不连续PAGE
5
PAGE的特点
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三、PAG的浓度与孔径的关系
the initial concentrations of acrylamide and BIS control the hardness and degree of crosslinking of the gel.
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pH8.3 Tris-Glycine buffer
样品
样品胶 浓缩胶
分离胶
甘氨酸 蛋白质 HCl
区低 电 导
.
3）pH值的不连续性 为了控制慢离子的解离度，从而控制其有
效迁移率，必须使浓缩胶与分离胶之间pH值 有所区别。
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3.分子筛效应与电荷效应 进入分离胶后，Gly-成为快离子 分离胶只有电荷效应和分子筛效应，根据
聚丙烯酰胺凝胶电泳
Polyacrylamide Gel Electrophoresis ，
P李A莉GE
1
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小
结
1.掌握（不连续）PAGE的原理 2.掌握影响PAGE迁移率的因素 3.掌握PAGE的操作注意点、试剂作用 4.熟悉PAG的聚合
.
思考题
名词解释 1.凝胶总浓度 2.交联度 问答题 1.与CAME相比，PAGE有哪些特点。 2.试比较CAME与PAGE操作的区别。 3.简述不连续PAGE的原理。