土壤酶的测定方法.

一、脲酶测定(苯酚钠-次氯酸钠比色法)

脲酶是对尿素转化起关键作用的酶，它的酶促反应产物是可供植物利用的氮源，它的活性可以用来表示土壤供氮能力。

1、试剂配制：

（1）pH6.7柠檬酸盐溶液：取368g柠檬酸溶于600mL蒸馏水中，另取295g氢氧化钾溶于水，再将两种溶液合并，用1N氢氧化钠将pH调至6.7，并用水稀释至

2L。

（2）苯酚钠溶液：称取62.5g苯酚溶于少量乙醇中，加2mL甲醇和18.5mL丙酮，后用乙醇稀释至100mL（A液），保存再冰箱中。称取27g氢氧化钠溶于100mL

水中（B液），保存于冰箱中。使用前，取A、B两液各20mL混和，并用蒸馏

水稀释至100mL备用。

（3）次氯酸钠溶液：用水稀释制剂至活性氯的浓度为0.9％，溶液稳定。

（4）10％尿素溶液：10g尿素溶于100mL水中。

（5）N的标准溶液：精确称取0.4717g硫酸铵溶于水稀释至1L，则得1mL含0.1mgN 的标液，再将此液稀释10倍制成氮工作液（0.01mg/mL）。

标准曲线绘制：分别取0、0.5、1.5、2.5、3.5、4.5、5.5、6.5mL氮工作液置于25mL刻度试管中，加蒸馏水至10mL，再加2mL苯酚钠溶液和1.5mL次氯酸钠溶液，随加随摇匀，20min 后显色，定容25mL。1h内再分光光度计上于578nm处比色。

102030405060700

0.20.40.6

2、操作步骤

（1）称取2.5ｇ土置于25mL 刻度试管中, 加0.5mL 甲苯处理,加塞塞紧轻摇15min;往瓶中加入2.5mL10%尿素液和5mL 的柠檬酸盐缓冲液(ｐＨ6.7),仔细混匀。在37℃恒温箱中培养3ｈ。（当脲酶活性为3~80微克NH3-N 时，本法能获得可靠的结果。若脲酶活性小于3微克，培养时间需增至24h ）。

（2）然后用热至38℃的蒸馏水稀释至刻度(甲苯应浮在刻度以上),摇荡,将悬液过滤。对每一土样，设置用水代替基质的对照。对整个实验，进行无土壤基质的对照，以检验实验的纯度。

（3）取滤液0.5mL 置于25mL 刻度试管中,用蒸馏水稀释至5mL,然后加入2mL 苯酚钠溶液,并立即加入1.5mL 次氯酸钠溶液，加入每一试剂后,立即将混合物摇匀,20ｍｉｎ后,将混合物稀释至刻度,

（4）在波长578ｎｍ处测定吸光值。脲酶活性以样品所得的吸光值减去对照样品吸光值之差,根据标准曲线求出氨态氮量。

3、结果计算

以3/24小时后1g 土壤中NH 3－N 的质量（mg ）表示脲酶活性（Ure ）

Ure ＝a ·V ·n/m

式中：a 为由标准曲线求得的NH 3－N 浓度（mg/mL ）；V 为显色液体积（50mL ）0.5；n 为分取倍数50；m 为烘干土重（g ）2.5。 注意事项：

1. 每一个样品应该做一个无基质对照，以等体积的蒸馏水代替基质，其他操作与样品实验

相同，以排除土样中原有的氨对实验结果的影响。

2. 整个实验设置一个无土对照，不加土样，其他操作与实验相同，以检验试剂纯度和基质

自身分解。

3. 如果样品吸光值超过标曲的最大值，则应该增加分取倍数或减少培养的土样。

二. 过氧化氢酶测定(紫外分光光度法)

1. 试剂配制

a. 0.3％过氧化氢溶液：按1:100将30%H 2O 2用水稀释

b. 1.5N 硫酸：取42mL 浓硫酸，稀释后定容至500mL

c. 0.02N 高锰酸钾（1/5KMnO4）溶液：称取化学纯高锰酸钾3.161g ，溶于1升无CO 2

蒸馏水中，贮于综色瓶中，备用。

d.饱和铝钾矾：十二水硫酸铝钾在20℃溶解度为10.84g,30℃的溶解度为15.41g

2. 操作步骤

（1）取2g 风干土，置于100mL 三角瓶中，并注入40mL 蒸馏水和5mL 0.3％H 2O 2溶液（现配）。同时设置对照，即三角瓶中注入40mL 蒸馏水和5mL 0.3％过氧化氢溶液，而不加土样。将三角瓶放在振荡机上振荡20min 后，迅速加入饱和铝钾矾溶液1mL, 6000rad 离心15min 。取上清液9mL 加入盛有1mL1.5N 硫酸（以稳定未分解的过氧化氢），摇匀后。溶液在240nm 处比色，测定吸光度As 。同时做无土对照A0和无机质对照Ak 。

3. 结果计算

W T Ae E ⨯=

,Ak As A Ae +-=0，170

051

⨯⨯⨯⨯=V A V C T 其中，E 是土壤过氧化氢酶的活性； T 是单位吸光度相当于过氧化氢的克数， A0是无土对照，即空白溶液的吸光度， As 是样品溶液的吸光度， Ak 是无基质溶液的吸光度 C 是高锰酸钾的浓度，C=0.02mol/L

V 是吸取V0mL （10ml ）的无土对照即空白溶液用高锰酸钾滴定所消耗的高锰酸钾溶液体积，0.1。

W 是有效土壤质量。g 4.0945

2

=⨯

数据获取时间：2012-8-22到2012-8-24 A01=0.084；

三、蔗糖酶测定（比色法）：

1、试剂配制

（1）3，5－二硝基水杨酸溶液：称0.5g 二硝基水杨酸，溶于20mL2N 氢氧化钠和50mL 水中，再加30g 酒石酸钾钠，用水稀释至100mL （不超过7天）。

（2）pH5.5磷酸缓冲液：1/15M 磷酸氢二钠（23.876g 磷酸氢二钠.12H 2O 溶于1L 蒸馏水中）0.5mL 加1/15M 磷酸二氢钾（9.078g 磷酸二氢钾溶于1L 蒸馏水中）9.5mL 即成。 （3）8％蔗糖溶液：80g 蔗糖溶于1000mL 水中 （4）甲苯

（5）标准葡萄糖溶液：将葡萄糖预先在80℃烘至恒重。然后取500mg 溶于100mL 蒸馏水