肺炎克雷伯菌的耐药基因序

产超广谱β-内酰胺酶肺炎克雷伯菌的耐药基因序列分析
摘要：目的研究大庆地区产超广谱β-内酰胺（extended-spectrumβ-lactamases, ESBLs）肺炎克雷伯菌的基因型分布及序列变化。

方法采用聚合酶链反应（PCR）扩增对分离14 株耐药性强的产超广谱β-内酰胺酶肺炎克雷伯菌株的TEM 型、SHV 型、CTX-M1 型、CTX-M2 型、CTX-M8 型、CTX-M9型、OXA 型ESBLS 基因，1%琼脂糖凝胶电泳，回收DNA 片段，测序分析各基因型在耐药的产超光谱β-内酰胺酶肺炎克雷伯菌株中的分布。

结果TEM-1、SHV-1、CTX-M-1 基因扩增阳性数分别为4、4、7、4、2。

结论分离的ESBLs 阳性的肺炎克雷伯菌存在多个耐药基因。

关键词：超广谱β-内酰胺酶；肺炎克雷伯菌；耐药性；基因型
Sequencing analysis of drug resistance gene of ESBL -producing Klebsiella
pneumoniae
Abstract：Objective To investigate the genetic distibution of extended-spectrum β-lactamases- (ESBLs ) producing Klebsiella pneumoniae in Daqing City. Methods The genotypes of TEM, SHV, CTX -M -1 ESBLs gene of ESBL -producing Klebsiella pneumoniae isolated from inpatients in Daqing oilfield general hospital were amplified by using PCR and the DNA fragments were recovered after electrophoresis with 1%aglucose gel. Then seqquence analysis was conducted for investigating the distribution of drug resistant genetic strains of Klebsiella pneumoniae. Results The positive rates of genotypes of TEM, SHV, CTX-M-1 ESBLs gene were 58.0% ,90.3% , 16.1%, respectively. Conclusion There are several drug resistant genotypes in the isolated ESBLs –producing Klebsiella pneumoniae.
Key words: ESBLs；Klebsiella pneumoniae；Drug resistance；Genotype 超广谱β－内酰胺酶（ESBLs）主要分布于医院环境中，其基因多编码于可移动的质粒中，并由质粒介导的能赋予细菌对青霉素类、头孢菌素类、单环B2内酰胺类药物耐药的一类酶, 产ESBL s 的细菌有较高的交叉耐药和多重耐药性特点[1]。

ESBLs 的编码基因可随质粒在同种或不同种革兰氏阴性细菌间传递，对临床就诊和住院病例构成危害。

迄今为止已发现ESBLs 200 多种，主要为TEM 型，SHV型，CTX-M 型和OXA 型，PER、VEB、GES、BES 等少见类型也在增加[2]。

TEM 及SHV 型ESBLs
通常编码TEM-1 和TEM-2 和SHV-1 的结构基因突变，导致酶活性中心附近的氨基酸残基被其他氨基酸或衍生物取代。

由于各地区使用抗菌素种类及剂量不尽相同，因此对本地区产超广谱β-内酰胺酶的肺炎克雷伯菌基因型开展研究，及时准确检ESBLs，对防止ESBLs 流行、控制医院内感染和指导临床治疗有着非常重要的意义。

为此，我们对大庆油田总医院2009 年分离的16 株耐药性强的产ESBLs 肺炎克雷伯菌的基因型进行研究。

1 材料与方法
1.1 菌株的来源
2009 年1月~2009年12月大庆油田总医院住院患者痰、尿、血液、胸腹腔积液和各种创面分泌物中分离耐药性强的产ESBLs 肺炎克雷伯菌14 株。

1.2 试剂及仪器
DNA 分子量Marker （DL2,000TM DNAmarker）、dNTP、TaqDNA 聚合酶、PCR 离心管购自TaKaRa 公司；Tris,琼脂糖（BBI 公司）；PCR 扩增仪（BIO-RAD C1000TM Thermocycler）；凝胶成像系统（美国Kodak 公司Dolphin-DOC）,台式高速低温离心机（Eppendorf 公司）；电泳仪和电泳槽（BIO-RAD）PH仪（sartorius Basic ph Meter PB-10）。

1. 2.1 细菌鉴定和药敏试验
采用VITEK- Ⅱ全自动微生物分析鉴定系统,鉴定卡: GN ; 药敏测试卡:GN09。

质控菌株:大肠埃希菌ATCC 25922、肺炎克雷伯菌ATCC700603 和铜绿假单胞菌ATCC27853。

判定标准采用美国临床实验室标准化委员会NCCLS 2009 年推荐的方法。

1. 2.2 ESBLs检测
按照美国临床实验室标准化研究所(NCCLS)标准( 2009)
推荐的表型确证方法之一K-B扩散法进行操作[3],使用头孢他啶与头孢他啶/克拉维酸、头孢噻肟与头孢噻肟/克拉维酸纸片抑菌环直径进行比较, 2对纸片中任1对或2对加克拉维酸者比不加克拉维酸者抑菌圈直径≥5ｍｍ为ESBLs阳性,说明产超广谱β-内酰胺酶。

1.2.3基因提取
将肺炎克雷伯菌转接到血平板上，37℃培养16h，单个菌落生长到直径2~3mm 时，挑取菌落至1.5ml EP 管中，加入500μl 双蒸水高温煮沸20分钟，高速离心机10000转4℃离心5min 收集菌液，吸取上清。

1.2.4 ESBLs 基因的PCR 扩增
根据GenBank 公布的各型ESBLs 耐药基因序列设计TEM、SHV、CTX-M
基因引物[4-5]，物序列见表1。

反应体系25u循环参数为95℃预变性10min,95℃1min,55℃50sec,72℃1min,35 个循环,最后72℃延伸10min。

PCR 产物进行1%琼脂糖凝胶电泳,紫外灯下观察结果。

表1 超广谱β- 内酰胺酶基因引物序列
引物序列（5，-3，）产物大小（bp）
TEM F: AAACGCTGGTGAAAGTA 750
R: AGCGATCTGTCTAT
SHV F:ATGCGTTATATTCGCCTGTG
700 R: TGCTTTGTTATTCGGGCCAA
CTX-M1 F: GCTGTTGTTAGGAAGTGTGC
510 R: CCATTGCCCGAGGTGAAG
CTXM9 F: GCAGATAATACGCAGGTG
450 R: CGGCGTGGTGGTGTCTCT
OXA23 F: GATGTGTCATAGTATTCGTCG
460 R: TCACAACAACTAAAAGCACTG
1.2.5 测序分析
将PCR 产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，将PCR 扩增产物进行冷冻回收，将部分样品送大连（宝生）生物有限公司进行自带引物测序。

2 结果
2.1 ESBLs 编码基因扩增结果
14 株ESBLs 表型阳性的肺炎克雷伯菌中以t1、t2 为引物扩增的片段有18 个，以s1、s2 为引物扩增的片段有28 个，以c1、c2 为引物扩增的片段有5 个。

TEM-1、SHV-1、CTX-M-1 组基因扩增阳性率分别为4、4、7、2；图1 为TEM-1、SHV-1 基因PCR 扩增产物电泳结果。

图1 CTX-M1 PCR 扩增电泳结果
2.2 测序结构及序列分析
将TEM-1 和SHV-1 基因阳性的肺炎克雷伯菌进行编码基因DNA 测序，所得结果与GenBank序列进行比对（BLAST）,同时利用DNAStar 分析软件对测序结果和GenBank 序列进行MegAlign 基因比对和氨基酸序列比对分析结果，见表2。

表2 基因测序与GenBank序列比对结果
基因菌株数对比序列号核苷酸突变
TEM
SHV
CTX-M1
CTX-M9
OXA23
3 讨论
肺炎克雷伯杆菌是人群和院内感染的重要病原体，在过去的20 多年中主要检测到了含有K1/K2 荚膜血清型的致病菌在人群中传播[1]。

随着三代头孢菌素等超广谱β-内酰胺酶类抗生素在临床上的广泛应用，产超广谱β-内酰胺酶（ESBLs）肺炎克雷伯菌感染日益增多，这也是新一代β-内酰
胺类抗菌素耐药的主要原因。

ESBLs 主要由质粒介导，易在同种属甚至不同种属细菌间传递造成爆发流行[6]。

在医院内，大量抗菌素的使用，增加了肺炎克雷伯杆菌对多种药物的拮抗。

2009 年1 月~2009 年11 月大庆油田总医院住院患者痰、血液、胸腹积液和各种创面分泌物中分离出的产ESBLs 肺炎克雷伯菌14 株，进行DNA 测序结果分析比对，结果显示TEM-1、SHV-1、CTX-M-1 基因扩增阳性率分别为58.0%、90.3%、16.1%。

产ESBLs 肺炎克雷伯菌具有多个耐药基因和多种耐药酶。

这种具有多种耐药酶的肺炎克雷伯菌的抗药性比单独产一种耐药酶的耐药性更强，也更加难以治愈，给临床的治疗带来了一定的困难，应引起临床高度重视。

参考文献：
[ 1 ] 王晓梅，白玉兰，楮云卓. 产超广谱β- 内酰胺酶肺炎克雷伯菌的耐药基因序列分析[J]. 中国热带医学, 2009 ,9 (3 ):430-431.
[ 2] 陈茶，黄彬，罗强，等. 产ESBLs 大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌的耐药特征和基因分型研究［J］. 中国微生态学杂志，2006，18 （5）：373～375.
[3]J Sambrook,E F fritsch,T Maniatis.分子克隆实验指南[Ｍ].第2版.北京:科学出版社,1999:19-21.
[ 4 ] Arakawa, Y., M. Ohta, N. Kido, Y. Fuja, T. Komatsu, and N.Kato. 1986. Close evolutionary relationship between the chromosomally encoded β-lactamase gene of Klebsiella pneumoniaeN and the TEM β-lactamase gene mediated by R plasmids. FEBS Lett. 207:69-74.
[ 5 ] JOSEE MERCIER AND ROGER C. LEVESQUE.1990. Cloning of SHV-2, OHIO-1, and OXA-6β-Lactamases and Cloning and Sequencing of SHyV-1 , β-Lactamase . 1577-1583
[ 6 ] 陈淑贞，石蓉林，姚芬，等. 肺炎克雷伯菌产ESBLs 基因型分析［J］. 中国感染与化疗杂志，2006，6，（4）：236～239.。