肺炎克雷伯菌的耐药基因序

产超广谱β-内酰胺酶肺炎克雷伯菌的耐药基因序列分析

摘要：目的研究大庆地区产超广谱β-内酰胺（extended-spectrumβ-lactamases, ESBLs）肺炎克雷伯菌的基因型分布及序列变化。方法采用聚合酶链反应（PCR）扩增对分离14 株耐药性强的产超广谱β-内酰胺酶肺炎克雷伯菌株的TEM 型、SHV 型、CTX-M1 型、CTX-M2 型、CTX-M8 型、CTX-M9型、OXA 型ESBLS 基因，1%琼脂糖凝胶电泳，回收DNA 片段，测序分析各基因型在耐药的产超光谱β-内酰胺酶肺炎克雷伯菌株中的分布。结果TEM-1、SHV-1、CTX-M-1 基因扩增阳性数分别为4、4、7、4、2。结论分离的ESBLs 阳性的肺炎克雷伯菌存在多个耐药基因。关键词：超广谱β-内酰胺酶；肺炎克雷伯菌；耐药性；基因型

Sequencing analysis of drug resistance gene of ESBL -producing Klebsiella

pneumoniae

Abstract：Objective To investigate the genetic distibution of extended-spectrum β-lactamases- (ESBLs ) producing Klebsiella pneumoniae in Daqing City. Methods The genotypes of TEM, SHV, CTX -M -1 ESBLs gene of ESBL -producing Klebsiella pneumoniae isolated from inpatients in Daqing oilfield general hospital were amplified by using PCR and the DNA fragments were recovered after electrophoresis with 1%aglucose gel. Then seqquence analysis was conducted for investigating the distribution of drug resistant genetic strains of Klebsiella pneumoniae. Results The positive rates of genotypes of TEM, SHV, CTX-M-1 ESBLs gene were 58.0% ,90.3% , 16.1%, respectively. Conclusion There are several drug resistant genotypes in the isolated ESBLs –producing Klebsiella pneumoniae.

Key words: ESBLs；Klebsiella pneumoniae；Drug resistance；Genotype 超广谱β－内酰胺酶（ESBLs）主要分布于医院环境中，其基因多编码于可移动的质粒中，并由质粒介导的能赋予细菌对青霉素类、头孢菌素类、单环B2内酰胺类药物耐药的一类酶, 产ESBL s 的细菌有较高的交叉耐药和多重耐药性特点[1]。ESBLs 的编码基因可随质粒在同种或不同种革兰氏阴性细菌间传递，对临床就诊和住院病例构成危害。迄今为止已发现ESBLs 200 多种，主要为TEM 型，SHV型，CTX-M 型和OXA 型，PER、VEB、GES、BES 等少见类型也在增加[2]。TEM 及SHV 型ESBLs

通常编码TEM-1 和TEM-2 和SHV-1 的结构基因突变，导致酶活性中心附近的氨基酸残基被其他氨基酸或衍生物取代。由于各地区使用抗菌素种类及剂量不尽相同，因此对本地区产超广谱β-内酰胺酶的肺炎克雷伯菌基因型开展研究，及时准确检ESBLs，对防止ESBLs 流行、控制医院内感染和指导临床治疗有着非常重要的意义。为此，我们对大庆油田总医院2009 年分离的16 株耐药性强的产ESBLs 肺炎克雷伯菌的基因型进行研究。

1 材料与方法

1.1 菌株的来源

2009 年1月~2009年12月大庆油田总医院住院患者痰、尿、血液、胸腹腔积液和各种创面分泌物中分离耐药性强的产ESBLs 肺炎克雷伯菌14 株。

1.2 试剂及仪器

DNA 分子量Marker （DL2,000TM DNAmarker）、dNTP、TaqDNA 聚合酶、PCR 离心管购自TaKaRa 公司；Tris,琼脂糖（BBI 公司）；PCR 扩增仪（BIO-RAD C1000TM Thermocycler）；凝胶成像系统（美国Kodak 公司Dolphin-DOC）,台式高速低温离心机（Eppendorf 公司）；电泳仪和电泳槽（BIO-RAD）PH仪（sartorius Basic ph Meter PB-10）。

1. 2.1 细菌鉴定和药敏试验

采用VITEK- Ⅱ全自动微生物分析鉴定系统,鉴定卡: GN ; 药敏测试卡:GN09。质控菌株:大肠埃希菌ATCC 25922、肺炎克雷伯菌ATCC700603 和铜绿假单胞菌ATCC27853。判定标准采用美国临床实验室标准化委员会NCCLS 2009 年推荐的方法。

1. 2.2 ESBLs检测

按照美国临床实验室标准化研究所(NCCLS)标准( 2009)

推荐的表型确证方法之一K-B扩散法进行操作[3],使用头孢他啶与头孢他啶/克拉维酸、头孢噻肟与头孢噻肟/克拉维酸纸片抑菌环直径进行比较, 2对纸片中任1对或2对加克拉维酸者比不加克拉维酸者抑菌圈直径≥5ｍｍ为ESBLs阳性,说明产超广谱β-内酰胺酶。

1.2.3基因提取

将肺炎克雷伯菌转接到血平板上，37℃培养16h，单个菌落生长到直径2~3mm 时，挑取菌落至1.5ml EP 管中，加入500μl 双蒸水高温煮沸20分钟，高速离心机10000转4℃离心5min 收集菌液，吸取上清。

1.2.4 ESBLs 基因的PCR 扩增

根据GenBank 公布的各型ESBLs 耐药基因序列设计TEM、SHV、CTX-M