BD多色流式全面解决方案

BD Horizon™ 之旅: 多色方案设计的新视野/29
CS&T 系统的益处
• 科学家/使用者 – 从多色实验中得到高质量的数据 • 每天提供稳定并可重复的数据
– 根据实验条件优化仪器设置 • 提供每次实验时仪器状态的参数
• 平台负责人/操作者 – 尽早发现仪器性能的下降 • 帮助确定问题的来源 – 提供设置仪器的信息（系统电子背景噪音）
APC APC-Cy7
APC Alexa Fluor 700 APC-H7/APC-Cy7
APC Alexa Fluor 700 APC-H7/APC-Cy7
BV421/V450
BV421/V450
BV510/V500
BV510/V500
BV421/V450
BV605
BV605
BV510/V500
BV650
V450
BV510
BV605
BV421
CD 3
CD4
• 合适的荧光素选择帮助我们更好的理解实验 • 对于弱的抗原，亮的染料尤为重要
BD Horizon™ 之旅: 多色方案设计的新视野/6
1
荧光素的选择是关键
BV421
CD197 (CCR7)
V450
FITC
PerCP-Cy5.5 PE
PE-CF594
检测光学部件需匹配所用的 荧光素
• 许多仪器已经配置可以使 用纳米晶体染料
• 为最大限度地发挥BD Horizon Brilliant Violet 的 组合优势，仪器可能需要 更新配置
• 更新配置可提高扩展仪器 的性能
BD Horizon Brilliant Ultraviolet (BUV)
BUV395 中等亮度
5
3
Hu CD127
37
9
4
Ms CD11b
Hu CD19
Hu CD127
BD Horizon™ 之旅: 多色方案设计的新视野/18
3
9/18/2014
Better resolution of dim markers
CD25 FITC
CD25 BB515
CD25 FITC or CD25 BB515 and CD3 PerCP-Cy5.5, CD4 APC, CD127 PE
CD4 CD45RA
CD25
抗原密度列表
在表达最低密度的抗原上匹配最亮的荧光素 • 抗原密度一定是在细胞亚群水平上确定的 • 这个规则会由于通道间相互溢漏，共表达等原因有所改变 • 抗原密度也会由于激活状态而有所改变
BD Horizon™ 之旅: 多色方案设计的新视野/22
抗原和荧光素的组合
low
medium
9/18/2014
BD多色流式全面解决方案
BD生物科学 Judy
bdbiosciences.com /1
The BD Horizon™ Tour
Identification of immune cell subsets by eight-color antibody staining
BD Horizon™ 之旅: 多色方案设计的新视野/2
BD Horizon™ 之旅: 多色方案设计的新视野/30
5
9/18/2014
荧光溢漏
bdbiosciences.com /31
The BD Horizon™ Tour
荧光溢漏的重要性
1. 多色方案群体分辨率
为了使感兴趣的群体获得最好的分辨率，荧光溢漏是方案设计时 唯一最为重要的因素。
2. 复杂数据的可视性
Hu CD4
Hu CD3
Stain Index
x Brighter
BB515 FITC A488 PE FITC A488
Hu CD3
302 43 81
7
4
Hu CD4
174 47 58 166
4
3
Hu CD19
85 16 15 40
5
6
Ms CD8a
86 24 50 151
4
2
Ms CD11b
68 15 26
分辨率的重要性 优化仪器设置：CS&T 荧光溢漏
bdbiosciences.com /25
The BD Horizon™ Tour
分辨率 分辨率 –
流式细胞仪区分弱染色信号和未染色信号的程度 在多色情景下更为复杂
清晰分群的能力取决于背景和阴性群体的分散度。
BD Horizon™ 之旅: 多色方案设计的新视野/26
Nat Rev Immunol,2012
Eight-color antibody panels proposed by the Human Immunophenotyping Consortium
BD Horizon™ 之旅: 多色方案设计的新视野/3
Nat Rev Immunol, 2012
主要内容
− 在特定细胞亚群共表达的marker应该偶联光谱分离的荧光素
T 细胞panel中-可能用到的marker: CD3, CD4, CD8, CD45RA, CD27, CCR7, CD25, CD127
BD Horizon™ 之旅: 多色方案设计的新视野/24
4
9/18/2014
优化仪器配置，提高分辨率
BD Horizon™ 之旅: 多色方案设计的新视野/8
基于仪器配置选择荧光素
488 nm 640 nm
405 nm
561 nm 355 nm # Lasers
BD Accuri™ C6 BD FACSVerse™ BD FACSVerse™ BD LSR™ Fortessa BD LSR™ Fortessa BD FACSCanto™ II BD FACSCanto™ II BD LSR Fortessa X-20 BD LSR Fortessa X-20
Transcription Factor Buffer Stain – Fix/Perm
Perm III Solution Stain - Fix/Perm
Fix/Perm - Stain
Hu CD4 BV510
BD Horizon™ 之旅: 多色方案设计的新视野/12
Fix/Perm - Stain Hu CD4 BV786
• CS&T是一个由软件（FACSDiva 和 FACSuite）和试剂（CST微球 ）整合而成的完整系统。
• CS&T 系统的作用 – 确定决定仪器性能，影响灵敏度/群体分辨率的因素 • 相对荧光检测效率 (Qr) • 相对光学背景 (Br) • 系统电子背景噪音 (SDen) – 标准化仪器设置 • 应用设置 – 跟踪仪器性能
多色方案中荧光素选择的重要性 荧光素同抗原的搭配 优化仪器配置，提高分辨率 多色Panel设计实例分析
BD Horizon™ 之旅: 多色方案设计的新视野/4
流式多色方案中荧光素选择的重要性
bdbiosciences.com /5
The BD Horizon™ Tour
荧光素的选择是关键
• 亮的染料 • 减少交叉激光激发 • 减少样品制备影响
BD Horizon™ 之旅: 多色方案设计的新视野/10
与其他染料的比较
BV421
BV711
PE
BV786
BV605
BV CD4 试剂与PE比较
BD Horizon™ 之旅: 多色方案设计的新视野/11
BV650 BV510
Buffer Compatibility – Surface Stain
BV650
BV711
BV711
BV786
BV786
PE
PE-CF594
PE-Cy5
PE-Cy7
BUV395
BUV395
BUV737
BUV737
2
2
3
4
5
BD Horizon™ 之旅: 多色方案设计的新视野/9
BD Horizon Brilliant™ Violet
• 六种被紫激光激发的染料 – 基础多聚体: BV421 and BV510 – 串联体: BV605, BV650, BV711 and BV786
亮度 阴性信号的宽度
• 亮度取决于 • 试剂 • 抗原密度，所用荧光素 • 仪器 • 通道电压增益，激光器能量
• 阴性群体的宽度取决于 – 仪器性能 – 检测效率, 背景荧光和电子噪 音 [单色] – 溢漏 [多色方案]
BD Horizon™ 之旅: 多色方案设计的新视野/28
流式细胞仪设置和跟踪(CS&T)系统
2
9/18/2014
Buffer compatibility : intracellular staining
Unstimulated
CMV pp65
SEB
CD4
IFN-g PE
IFN-g PE
BD Horizon™ 之旅: 多色方案设计的新视野/13
CD8
紫激光配置
BD Horizon™ 之旅: 多色方案设计的新视野/14
• Brightness: Very Bright • Ex Max 490 nm • Em Max 515nm • Filter: Same as FITC (e.g. 530/30 nm)
BD Horizon™ 之旅: 多色方案设计的新视野/17
BB515 is up to seven times brighter than FITC
BD Horizon™ 之旅: 多色方案设计的新视野/15
与其他染料的比较
BUV395
BUV737
BV421 PE
FITC
BD Horizon™ 之旅: 多色方案设计的新视野/16
BUV CD4 试剂 与 PE, BV421 和 FITC 比较
BD Horizon Brilliant Blue (BB515)
• Secondary: 很好鉴定，较高水平表达，经 常连续性表达 – Examples: CD27, CD28, CD45RA, CD45RO
• Tertiary: 低水平表达，激活性marker，或者 表达区分不明显 – Example: CD25
Mahnke YD, Roederer M. Optimizing a multicolor immunophenotyping assay. Clin Lab Med. 2007; 27:469-485. BD Horizon™ 之旅: 多色方案设计的新视野/21
high
BD Horizon™ 之旅: 多色方案设计的新视野/23
抗原共表达
Marker的共表达：
− Population resolution is impacted by spillover. 细胞群的分辨率 会受到通道溢漏的影响
− Markers co-expressed on specific cell types should be conjugated to spectrally separated fluorochromes.
BD Horizon™ 之旅: 多色方案设计的新视野/19
荧光素同抗原的搭配
• 理解抗原表达的特性 • 选择最合适荧光素偶联的抗体
bdbiosciences.com /20
The BD Horizon™ Tour
抗原的分类
Fra Baidu bibliotek
三大类: • Primary: 很好鉴定，容易区分阴阳性细胞群，
阴阳性峰分得很开 – Examples: CD3, CD4, CD45
Exmax/Emmax: 348 nm/395 nm 滤光片: 379/28BP
BUV737 明亮
Exmax/Emmax: 348 nm/737 nm 滤光片: 740/35BP; 690LP
两种被355nm紫外激光激发的新荧光素 • BUV395: 对其他检测其几乎无溢漏
• BUV737: 对Alexa Fluor 700中等溢漏
Alexa Fluor Alexa Fluor
647
700
CD3
选择正确的荧光素组合是回答生物学问题的关键
BD Horizon™ 之旅: 多色方案设计的新视野/7
荧光素分辨率等级
9/18/2014
• 等级由细胞经不同克隆，不同规格的抗体在多种流式细胞仪上的实验所得的染色指数（分辨 率）的比较决定
• 激光器的能量，PMT电压，光学部件，抗体克隆和生物样品等多种因素均会影响荧光素/试 剂在某个特定仪器上的效果
FITC PE PerCP-Cy5.5
FITC PE PerCP-Cy5.5 PE-Cy7
FITC PE PerCP-Cy5.5 PE-Cy7
FITC （ BB515） PE PE-CF594 PerCP-Cy5.5 PE-Cy7
FITC （BB515） PerCP-Cy5.5
APC
APC APC-Cy7
分辨率 vs. 背景
阴性群体背景低，分群清晰。
“Negative” Dim
Bright
阴性群体背景高，不能清晰分 群。
阴性群体背景低但分散度（相 对标准偏差）大，不能清晰分 群。
BD Horizon™ 之旅: 多色方案设计的新视野/27
染色指数: 分辨率的度量标准
染色指数

亮度/MFI 阴性信号的宽度/SD