细胞迁移和侵袭实验技术.

滤膜（聚碳酸脂膜）将小室分隔成上下两部分。靶细胞 在上面，趋化因子在下面，趋化因子通过滤膜形成梯度，细 胞则沿着梯度穿过膜孔，黏附在膜的下面，计数滤膜下表面 的细胞数即可测出趋化因子的趋化能力。
Boyden Chamber 装置
实验步骤
1. 在冰盒内将趋化因子由高浓度向低浓度稀释，将不同浓度的 趋化因子臵于趋化小室的下室，30ml/孔，每个浓度加3 个 孔，其中只加BM的孔为阴性对照； 2. 取对数生长期细胞，0.1%BM 重悬细胞，调整细胞浓度为 5×105/ml； 3. 加样：下室加不同浓度的趋化因子，将膜轻轻对折后展平， 光面朝下毛面朝上，依次盖上胶垫和上室将螺丝对称拧上 拧紧;在上室中加入细胞，50ml/孔，每个浓度加3 个孔；
原理
滤膜孔径一般为8mm，而且膜孔都被Matrigel覆盖，细胞 不能自由穿过，必须分泌水解酶，并通过变形运动才能穿过 这种铺有Martrigel 的滤膜，这与体内情况较为相似。
Transwell 电镜图片
实验步骤及注意事项
1. 无菌条件下 Matrigel 于冰浴融化，用PBS（或DMEM only 培养基） 稀释成1mg/ml 浓度，-20°C 冻存备用； 2. 取出已稀释好的 Matrigel，冰浴融化，以50ml 的体积铺于Tramwell 小室（24孔板）聚碳酸酯膜上（注意：体积不可太大，以刚把聚碳酸 酯膜浸湿为最好），37°C 放臵lh，使Matrigel 聚合成凝胶（注意： 加基质胶时最好将24 孔板放臵在冰盒上，确保胶完全覆盖孔底，不 要有气泡）；
100
Cell Numbers/HPF
80 60 40 20 0 scr
***
0 1 10 100
#1 #2 MDA-MB-231
#3
肿瘤细胞侵袭试验
Matrigel Invassion Assay
Transwell 系统
Transwell 小室
0.4um孔径聚碳
酯膜的扫描电镜
原理
人工重构基底膜材料Matrigel，是一种细胞外基质，4℃ 时是液体，在37 ℃ 会逐渐凝固成胶状。主要成分为层黏连 蛋白和Ⅳ型胶原，能在培养基中重建形成膜结构，这种膜结 构与天然基质膜结构极为相似。
操作步骤
1．先用marker笔在6孔板背后，用直尺比着，均匀的划横 线，大约每隔0.5~1cm一道，横穿过孔。每孔至少穿过3 条线。
操作步骤
2. 在孔中加入约5×105个细胞，具体数量因细胞种类不 同而不同，接种原则为过夜后融合率达到100%； 3.用10ml tip 枪头用力均匀地在培养皿中划痕，PBS 洗涤 2 次，去除划下的细胞，加入无血清培养基。
Hale Waihona Puke Baidu
注意事项
1. 膜，胶垫，上下小室之间防止有气泡产生； 2. 放膜时要对准位臵，过多调整位臵，易发生交叉污染。 3. 枪垂直，枪尖伸入孔中下大概4/5 处，迅速加样，不要迟疑， 打出液体的过程枪逐渐抬起，液体全部打出时枪尖离开液 面。
4. 洗膜时注意，不要把细胞面与非细胞面弄反。
EGF(ng/ml)
实验步骤
4. 将趋化小室在 37℃，5% CO2 的孵化箱中孵育3h； 5. 在膜的两端加上夹子，毛面在PBS 液面上蘸取，光面禁止 碰到液体。毛面在架子上摩擦，再蘸取PBS，反复3 次后 再蘸取一次，晾干； 6. 固定, 染色
实验步骤
7. 取载玻片，剪角放在右上角，滴一滴石蜡，盖玻片封片； 8. 显微镜观察计数，每孔至少 3 个随机视野，3 个孔的数值取 平均值;作柱状图，纵轴趋化指数或细胞数，横轴组别； 9. 趋化指数(Chemotaxis Index)=随着趋化诱导因子的浓度梯度 而迁移的细胞数目/用培养基做对照的迁移细胞数目
注意事项
1.在用PBS缓冲液冲洗时，注意贴壁慢慢加入，以免冲散单层贴壁细 胞，影响实验拍照结果。 2.一般做划痕实验，都是无血清或者低血清（<2%）否则细胞增殖 就不能忽略。 3. 按照6孔板背后画线的垂直方向划痕，可以形成若干交叉点，作 为固定的检测点，以解决了前后观察时位臵不固定的问题。 4. 实验时应注意细胞生长状况，选择适当的细胞接种浓度。对不同 的细胞要观察细胞的贴壁率等，确定实验时细胞的接种数量和培 养时间，保证培养终止时密度适当。
操作步骤
4．放入37℃ 5% CO2培养箱培养。每3h 测量一次细胞运 动的距离，拍照(具体时间依实验需要而定)。
操作步骤
5. 数据处理：每个时间点的距离长度-0 时距离=每个时间长 度细胞整体迁移的距离，求出均数和标准差，时间为横轴， 迁移距离为纵轴（单位mm）作图，并比较初始0 时与实验结 束时实验组与对照组的照片。
实验步骤及注意事项
3. 每孔加入 200ml 1640（或DMEM）培养基使胶重构； 4. 在 Transwell 下室中加入趋化因子或10%FBS 培养基600ml/孔； 5. 在上室孔中准确加入细胞 l×105 个/孔，细胞悬液体积200ml， 臵于5%CO2 培养箱于37°C 培养24h（注意：细胞量和时间根 据实验条件摸索）； 6. 待培养时间结束后，弃去上室液体，小心取出上室，用湿棉签 擦去膜上未穿过膜的细胞；
肿瘤细胞运动实验技术
肿瘤细胞生物学实验室 张宁PI组
肿瘤细胞运动
体内实验： 皮下移植瘤模型 原位移植瘤模型
体外实验
Text 划痕实验 in here
侵袭实验
肿瘤细胞运动 常用研究方法
趋化运动
划痕实验（伤口愈合实验，Scratch Assay）
实验原理
细胞划痕法是测定了肿瘤细胞的运动特性的方法 之一。在体外培养的单层细胞上，划痕致伤，然后 在加入药物等实验条件下观察其对肿瘤细胞迁移的 影响。
趋化运动实验（Chemotaxis Assay） 实验原理
趋化运动是指细胞能够感受到外界化学物质的 浓度梯度，并沿着浓度梯度的方向所做的定向运动。 趋化运动是一个非常保守的过程，对于生物体的生 存、生命的繁衍等具有重要的意义。
微孔小室中的趋化实验
微孔小室中的趋化实验是根据靶细胞（单核巨噬细胞， 中性粒细胞或淋巴细胞等）能够趋化性主动迁移，穿过一定 孔径的滤膜而设计的。