实验一植物中总糖的测定

实验一植物中总糖的测定

——3，5-二硝基水杨酸比色法

实验目的

（1）掌握总糖定量测定的基本原理

（2）熟悉3，5-二硝基水杨酸定糖法的基本操作

实验原理

各种单糖和麦芽糖是还原糖，蔗糖和淀粉是非还原糖。利用溶解性质不同，可将植物样品中的单糖、双糖、多糖分别提取出来。再用水解法使没有还原性的双糖和多糖彻底水解成有还原性的单糖。

在碱性条件下，还原糖与3，5-二硝基水杨酸共热，3，5-二硝基水杨酸被还原为3-氨基-5-硝基水杨酸（棕红色物质），还原糖则被氧化成糖醛酸及其他产物。在一定范围内，还原糖的量与棕红色物质的颜色深浅成比例关系，在540nm波长下测定棕红色物质的吸光度，通过标准曲线，便可求出样品中总糖的含量。多糖水解时，在单糖残基上加了一个分子水，因而在计算中需扣除已经加入的水量，测定所得的总糖量乘以0.9即为实际的总糖含量。

实验材料、仪器与试剂

1．实验材料

面粉

2．实验仪器

刻度试管或比色管，刻度吸管，恒温水浴锅，烧杯，容量瓶，电子天平，分光光度计，三角瓶。

3．试剂

（1）1mg/ml葡萄糖标准液：准确称取500mg分析纯葡萄糖，置于烧杯中，用少量蒸馏水溶解后，定量转移到500ml的容量瓶中。以蒸馏水定容至刻度，摇匀，冰箱中保存备用。

（2）a:3，5-二硝基水杨酸试剂：取6.5g3，5-二硝基水杨酸溶于少量热蒸馏水中，溶后移入1000ml 容量瓶中，加入325ml 2mol/L氢氧化钠溶液，再加入45g 丙三醇，摇匀，冷却，定容至1000ml。

b:3，5-二硝基水杨酸试剂：将6.3g 3，5-二硝基水杨酸和262ml 2mol/L 氢氧化钠溶液加到500ml含有185g酒石酸钾钠的热水溶液中，再加5g结晶酚和5g亚硫酸钠，搅拌溶解。冷却后加蒸馏水定容至1000ml，储于棕色瓶中备用。（3）碘-碘化钾溶液：称取5g碘和10g碘化钾，溶于100ml蒸馏水中。（4）酚酞指示剂：称取0.1g酚酞，溶于250ml70%乙醇中。

（5）6mol/L盐酸溶液

（6）6mol/L氢氧化钠溶液

操作步骤

1．葡萄糖标准曲线制作

取7支20mL 具塞刻度试管编号，按表1分别加入浓度为1mg/mL 的葡萄糖标准液、蒸馏水和3,5-二硝基水杨酸（DNS）试剂，配成不同葡萄糖含量的反应液。

将各管摇匀，在沸水浴中加热5min，取出后用自来水冷却至室温，加蒸馏水定容至25ml，混匀。在540nm波长下，以0号管为对照，分别测定其它六支

管的吸光度，并绘制标准曲线。

表1 葡萄糖标准曲线制作

管号 1mg/ml 葡萄糖标

准液(ml)

蒸馏水 （ml ） DNS （ml ）

葡萄糖含量 （mg ） 吸光度 (OD540)

0 0 2 1.5 0 1 0.2 1.8 1.5 0.2 2 0.4 1.6 1.5 0.4 3 0.6 1.4 1.5 0.6 4 0.8 1.2 1.5 0.8 5 1.0 1.0 1.5 1.0 6

1.2

0.8

1.5 1.2

2．总糖的水解和提取

准确称取1.00g 食用面粉，放入100mL 三角瓶中，加15mL 蒸馏水及10mL 6M HCl ，置于沸水中加热水解30min 。取1-2滴水解液于白瓷板上，加1滴碘-碘化钾溶液，检查水解是否完全。如已完全水解，则不显蓝色。待三角瓶中的水解液冷却后，加入1 滴酚酞指示剂，用6mol/L NaOH 中和至微红色，用蒸馏水定容在100mL 容量瓶中，混匀。将定容后的水解液过滤，取滤液10mL ，移入另一100mL 容量瓶中定容，混匀，作为总糖待测液。

表2 样品总糖测定

管号 总糖待测

液（ml ） 蒸馏水（ml ）

DNS （ml ） 光密度值 (OD540) 查曲线葡萄糖量（mg ）

7 1 1 1.5 8 1 1 1.5 9

1

1

1.5

按表2加入试剂后，其余操作与制作标准曲线相同。以制作标准曲线时的0号管为对照，测定各管吸光度，取平均值。 结果与计算

在标准曲线上查出相应的总糖的浓度，按下式计算面粉中总糖的含量。

1001000

9

.0%⨯⨯⨯⨯⨯

=

（g）（mg））（样品质量测定时取用量稀释倍数

提取液总量查曲线所得总糖含量总糖

注意事项

（1）样品量和稀释倍数的确定，要考虑本方法的检测范围，待测液的含糖量要在标准曲线范围内。

（2）标准曲线的制作与样品的测定要在相同条件下进行，最好是同时进行显色和比色。 思考题

（1）本实验中引起误差的原因有哪些？

（2）为什么说总糖的测定通常是以还原糖的测定方法为基础的？