细胞实验方法原理

一、细胞培养：

1. 细胞培养：从活的机体中取出组织或细胞，分散成单个细胞，模拟机体内的生长条件，在体外建立无菌、适温和一定营养条件等，使其在体外环境中继续生长繁殖的过程，并维持其结构和功能的技术。

2. 细胞培养的基本条件：无菌条件、细胞生长条件、细胞检测条件、细胞保存条件。

3. 无菌条件：

1）净化工作室：净化工作间是基于无菌条件下进行细胞培养操作的场所，设计标准为万级，专供细胞培养、冻存以及细胞治疗用。

①细胞培养间：一般由更衣间、缓冲间、操作间三部分组成。每周乳酸、过氧乙酸熏蒸（2

小时）和每月新洁尔灭擦拭地面和墙壁一次的方式进行消毒

②洁净层流罩：层流罩是可提供局部高洁净环境的空气净化的设备。主要由箱体、风机、

初效空气过滤器、中效空气过滤器、高效空气过滤器、阻尼层、灯具等组成。

③传递窗：该装置是一种洁净室的辅助设备，主要用于洁净区与非洁净区之间小件物品的

传递，以减少洁净室的开门次数，把对洁净区的污染降低到最低程度。

④无尘服

层流净化细胞培养室的总体要求：经济、有序、高效、安全。

相关制度：

I.准入制度：没有经过培训的人员不得单独进入净化室工作。

进入净化室后要保持安静，不得大声喧哗。

II.安全制度：谨慎使用酒精灯，实验人员自觉维护室内设备的安全使用，对室内的仪器如CO2孵箱等要经常注意机器运转情况，发现问题及时检修或报告请人检修。离开时断开必要的仪器电源。

III.卫生消毒制度：一般情况下细胞间每天消毒一次，方法为紫外线消毒（每次30分钟至1小时）一次，另外每周用10％乳酸在紧闭门窗下熏蒸30分钟；

实验完毕应及时清理所用物品，注意台面整洁；层流净化室实施值日生负责制。

IV.出入制度：总体原则为进出净化室应按次序开、关门，只有将前面打开的门关闭后才允许打开下一个门，使缓冲间起到应有的作用。

所有进出层流净化细胞培养室的物品均应通过传递窗进行，紫外灯照射15分钟

2）无菌操作的仪器设备：

①超净工作台：工作原理是利用鼓风机驱动空气经过高效滤器除去空气中的尘埃颗粒，使

空气得到净化。净化空气徐徐通过工作台面，使工作台内构成无菌环境。

使用前开启柜内紫外灯照射10－30分钟，预工作10－15分钟，以除去臭氧和使用工作台面空间呈净化状态。使用完毕后，要用70%酒精将台面和台内四周擦拭干净。

②生物安全柜：既能使操作造成无菌、无尘的局部空气环境，保证检验、检测不受污染，

又能保证被研究的对象（如病菌、细菌等）不外溢，保护周围环境及操作人员安全。

广泛应用于低、中等危险度（病原体1--3，DNA重组P1--P3）的临床细菌学，病毒学、微生物学、组织培养、生物学及生命科学的研究，加工、检验部门。

③高压灭菌锅：121℃，20min，适用于耐高温耐高压，不怕潮湿的物品（器械、细菌培

养基等）

④电热干燥箱：干热消毒，主要用于玻璃器皿消毒。

⑤紫外线：主要用于培养室空气、操作台、塑料培养皿和培养板等表面消毒。

⑥过滤除菌设备：0.45um和0.22um滤膜，大多数培养用液，如人工合成培养基、血清、

酶液等均采用滤过法除菌。

4. 培养细胞的生长条件：营养需要、生存环境（37℃、5%CO2、pH7.2-7.4）、无污染、无毒

①玻璃器皿的清洗：浸泡、刷洗、浸酸和清洗四个步骤

浸泡（自来水）→刷洗（洗衣粉）→泡酸（24小时）→流水冲洗→蒸溜水浸泡和冲洗→60-80℃烘干

②CO2培养箱：37℃，5%CO2，用螺旋口瓶培养细胞时，需将瓶盖微松，以保证通气；

保持培养箱内空气干净，定期消毒（90 ℃，14 h)；箱内蒸馏水槽中保持足够的灭菌蒸馏水以保持箱内湿度，避免培养液蒸发。

③水：一级水：基本上不含有溶解或胶态离子杂质及有机物。二级水经过石英设备蒸馏或

离子交换混合床处理后，再经0.2um 微孔滤膜过滤来制取。一级水用于有严格要求的分析试验，包括对颗粒有要求的试验，如高压液相色谱用水。

二级水：可含有微量的无机、有机或胶态杂质。可用多次蒸馏或离子交换等方法制取。

二级水用于无机痕分析等试验量分析等试验，如原子吸收光谱分析用水。

三级水：适用一般实验室实验工作。可以用蒸馏、离子交换等方法制取。

④平衡盐溶液：主要由无机盐和葡萄糖配制而成

作用：维持渗透压、缓冲和调节酸碱度，提供细胞生存所需的无机离子，主要作为合成培养基的基础溶液以及用于洗涤细胞组织等。

常用：生理盐水（0.9%），PBS，Hanks液

Hanks液是生物医学实验中最常用的无机盐溶液和平衡盐溶液，主要用于配制配制培养液、稀释剂和细胞清洗液，而不能单独作为细胞、组织培养液。

⑤pH调节液：碳酸氢钠

HEPES：一种可以保持细胞培养过程中pH值较长时间稳定的氢离子缓冲剂，通常使用浓度为10～15 mM。

⑥消化液：胰蛋白酶溶液：主要作用是使细胞间的蛋白质水解，从而使贴壁细胞从瓶壁上

脱落并使细胞游离分散开来，常用浓度为0.25%或0.5%胰蛋白酶，不含Ca2+\Mg2+\血清的平衡盐溶液配制，pH8左右，滤器过滤除菌。

EDTA溶液：作用机制是破坏细胞间的连接。对于一些贴壁特别牢固的细胞，可用EDTA 和胰酶的混合液，EDTA溶液的使用浓度为0.02%，Hanks液溶解后高压灭菌，配制时应加碱助溶（EDTA不能被血清中和）。

胶原酶溶液：胶原酶在上皮类细胞原代培养时经常使用，胶原酶作用的对象是胶原组织，因此不容易对细胞产生损伤，不受Ca2+\Mg2+\血清抑制，可采用磷酸缓冲液配制。

⑦抗生素溶液：通常是青霉素和链霉素联合使用，俗称“双抗溶液”。青霉素主要是对革兰

阳性菌有效，链霉素主要对革兰阴性菌有效。培养基内青霉素、链霉素最终使用浓度为每毫升100单位。

⑧培养基：是维持体外细胞生存和生长的溶液，分天然培养基和合成培养基。

天然培养基有血清、血浆、和组织提取液（如鸡胚和牛胚浸液）。

优点：营养成分丰富，培养效果好

缺点：来源受限；成分复杂，影响对某些实验产物的提取和实验结果的分析。

易发生支原体污染。