蛋白质的印迹分析(Westernblotting)

二、印渍技术的类别及应用
DNA印迹技术 Southern blotting
RNA印迹技术 Northern blotting
蛋白质印迹技术 Western blotting
斑点印迹 Dot blotting
原位杂交 in situ hybridization
DNA点阵
DNA array
（一）DNA印迹技术 (Southern blotting) 用于基因组DNA、重组质粒和噬菌体的 分析。
（二）RNA印迹技术 (Northern blotting) 用于RNA的定性定量分析。
（三）蛋白质的印迹分析 (Western blotting) 用于蛋白质定性定量及相互作用研究。
斑点印迹 Dot blotting
一、基本工作原理
Template DNA 5
5 5
Cycle 1
Primer 1 5 Primer 2
源自文库5 5
5 5
Cycle 2
5 5
5
5
5
5
5 5
5 5
5 5
Cycle 3
5
5
5
5
5
5
5
5
5 5
5 5
25～30 次循环后，模板DNA的含量 可以扩大100万倍以上。
基本方法
将DNA标本用限制性内切酶消化后，经琼脂糖凝 胶电泳分离各酶解片段；
经碱变性，Tris缓冲液中和，高盐下通过毛吸作用 将DNA从凝胶中转印至硝酸纤维素滤膜上，烘干 固定，凝胶中DNA片段的相对位置在DNA片段转 移到滤膜的过程中继续保持着。
附着在滤膜上的DNA与32P标记的探针杂交，利用 放射自显影术确定探针互补的每条DNA带的位置， 确定在众多酶解产物中含某一特定序列的DNA片 段的位置和大小。
（三）蛋白质印渍技术 Western blotting
又称为Western杂交，或免疫印渍技术， 即利用抗原-抗体反应，检测转移到硝 酸纤维素膜上的特异性蛋白质。
应用：用于检测样品中特异性蛋白质 的存在、细胞中特异蛋白质的半定量 分析以及蛋白质分子的相互作用研究 等。
三 种 印 迹 技 术 的 比 较
第一节
分子杂交与印迹技术
Molecular Hybridization & Blotting Technology
一、分子杂交与印迹技术的原理
核酸分子杂交 (nucleic acid hybridization ) 在DNA复性过程中，如果把不同DNA单链
分子放在同一溶液中，或把DNA与RNA放在一 起，只要在DNA或RNA的单链分子之间有一定 的碱基配对关系，就可以在不同的分子之间形 成杂化双链(heteroduplex) 。
Southern Blotting
无水乙醇
酚/氯仿
蛋白酶K
SDS
离心
tissue
Paper Towels
（二）RNA印渍技术 Northern blotting
又称为Northern杂交，即RNA-DNA杂交分析。 是一种将RNA从琼脂糖凝胶中转印到硝酸纤维 素膜上的方法。
主要用于检测某一组织或细胞中已知的特异 mRNA的表达水平以及比较不同组织和细胞的 同一基因的表达情况。
复性
RNA
DNA
（一）印渍技术 Blotting
首先由Edwen Southern在1975年提出。 Blotting即“印渍”，指将存在于凝胶中的生物
大分子转移（印渍）到固定化介质是病加以检 测分析的技术，目前广泛应用于DNA、RNA、 和蛋白质的检测
探针技术 probe
将一小段已知序列的核酸片段用放射性 同位素、生物素或荧光染料对它的末端 或全链进行进行标记，称为“探针”然 后用于分子杂交，杂交后通过放射自显 影、荧光检测或显色技术，使杂交区带 显现出来
二、PCR体系基本组成成分
模板DNA 特异性引物 耐热DNA聚合酶 dNTPs Mg2+
三、PCR的基本反应步骤
变性
95˚C
延伸 72˚C
退火
Tm-5˚C
四、PCR的主要用途
（一）目的基因的克隆 PCR技术是迅速获得一定量的目的基因以用于基 因克隆的有效方法之一。主要采用的方法有：
斑点杂交法是不经过电泳，而将被检标 本直接点到膜上，烘烤固定，用于杂交。 这种方法耗时短，可做半定量分析，一 张膜上可同时检测多个样品。
原位杂交 in situ hybridization
即组织原位杂交，指组织切片或细胞 涂片直接用于杂交分析。先经适当处 理，使细胞通透性增加，让探针进入 细胞内与DNA或RNA杂交。因此原位 杂交可以确定探针的互补序列在胞内 的空间位置，这一点具有重要的生物 学和病理学意义。
第二节
聚合酶链反应
Polymerase Chain Reaction
PCR技术 polymerase chain reaction
PCR即聚合酶链反应技术，是指利用耐热 DNA聚合酶的反复作用，通过变性-延伸复性的循环操作，在体外迅速将DNA模板 扩增数百万倍的一种操作技术。
理论上可在2小时内将一个DNA分子扩增 到106-109倍，从而大大提高对其进行分析 研究的速度。
DNA芯片技术 DNA chip
（一）DNA印迹技术 Southern blotting
又称为Southern杂交，即DNA-DNA杂交 分析。是研究DNA图谱的基本技术，主 要用于基因组DNA的分析，如在基因组 中特异基因的定位及检测等，亦可用于 分析重组质粒和噬菌体。 在遗传诊断 DNA图谱分析及PCR产物分析等方面有 重要价值。
进行嵌合、缺失、点突变等改造。 （三）DNA和RNA的微量分析
由于PCR技术具有高度敏感性，故可用 于微量DNA和RNA的分析检测。 （四）DNA序列测定 （五）基因突变分析
与反转录反应相结合，直接从组织和细胞的mRNA 获得已知目的基因片段；
利用特异性引物以cDNA或基因组DNA为模板，获 得已知的目的基因；
利用简并引物从cDNA文库或基因组文库中获得具 有同源性的DNA片段；
利用随机引物从cDNA文库或基因组文库中随机获 得目的基因。
（二）基因的体外突变 采用随意设计的引物，在体外对基因