图位克隆原理全版.ppt

利用酶切位点
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Marker: MIG5-B
HC C
L
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• dCAPs
= derived CAPS
设计引物引入错配碱基，精从选文而档 引入酶切位点
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其它标记
InDel
= insertion-deletion 插入缺失标记，指的是两 种亲本中在全基因组中的差异，相对另一个亲 本而言，其中一个亲本的基因组中有一定数量 的核苷酸插入或缺失。根据基因组中插入缺失 位点，设计一些扩增这些插入缺失位点的PCR 引物，这就是InDel标记。 部分SSLP就是由 InDel转化而来
• 例： Rf Marker1 Marker2 Marker3
6号个体
1
0
1
12号个体
1
0
0
表格的跑样结果显示Marker2最接近突
变位点，Marker3次之，下一步可以
在Marker2和Marker3附近寻找新标
记引物 精选文档
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重组子筛选
1. 建议使用一对位于相对确信的区域内的 次低重组率标记引用来筛选 2. 可以根据情况调整用来筛选 重组子的Marker 3. 要选择好用、绝大部分一次 就能扩出来的标记引物
mutant 杂交
图中的两个亲本不但在 A/a 位 点 有 差 异 ， 在 其 他位点也存在大量的遗 传差异，可以利用这些 差异设计分子标记，对 染色体的具体区段进行 标定。在该例子中，该 染色体上总共确定了5个 分子标记，标定了5个不 同区段。
F1 精pl选an文t档
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假设： 只存在单交换
自交
F2 plants
只有左侧三种植株会选入定位群体
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分子标记M5与突变位点的遗传距离：
M5处发生交换的 植株包括三种情况
10/100
6/100
4/100
(20/(100×2 )) ×100%=10cM
假设： 统计100个个体
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21
分子标记M4与突变位点的遗传距离：
6/100
4/100
统计计算Rf
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什么是重组子
• 在突变位点附近区域内绝大部分 的样品跑样结果都应该为只有非 重组的Col条带，即记录Rf为0， 只有少数的样品存在交换，Rf记 为1。
• 图中的6、12号样品即为重组子
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筛选重组子的目的
• 在筛选出6、12号两个重组子以后，假设 在目标区域内寻找到新的标记引物，就 不需要把所有的个体跑样，只需要跑重 组子个体
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** * * * **
Col Ler
2、3、7、9、12、16、17共7个样品，包含1个 来自于亲本Col的染色体区段以及1条来自于亲 本Ler的染色体区段，即发生了一次交换
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• 突变位点与分子标记M的遗传距离：
交换次数 配子总数
×100%
3×2 + 7
= 19 × 2
×100% ≈34 cM
• 密度： 每 6.6kb 存在一个
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SNP
= single nucleotide polymorphism
• 单核苷酸多态性 • 主要是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异
所引起的DNA序列多态性。SNP所表现的多态性 只涉及到单个碱基的变异，这种变异可由单个 碱基的转换或颠换所引起，也可由碱基的插入 或缺失所致。但通常所说的SNP并不包括后两种 情况。(后面两种情况的多态性一般归为InDel）
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29
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30
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31
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SSLPs 32
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SSLPs 33
• 40.48% • 4.76%
• 20.00%
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4.76% 12.5% 12.5% 36%
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筛选 F2 代 短根 移栽
3周左右
提基因组
各对引物PCR
步骤总结
缩小范围 寻找新Marker 扩大群体 (筛选重组子)
(10/(100×2 )) ×100%=5cM
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分子标记M3与突变位点的遗传距离：
4/100
(4/(100×2 )) ×100%=2cM
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如何分辨来自于两个亲本的染色体？
M4
m4 目前最常用的分子标记
是利用两个亲本中同一
染色体区段的长度差异
来设计的，如左图亲本
Ler的M4处染色体区段
• 密度： 每 3.3kb 存在一个
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9
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SSLPs 10
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11
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12
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13
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14
父本染色体
F1
母本染色体
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15
假设：
F1
Aa 突变位点
Bb Marker
突变为 隐性突变
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F1 配子
长根 长根
长根 长根
长根 短根
长根
长根 精选文档 短根
包含来自于 Col 两 条 染 色体区精段选文档
包含来自于 Ler 两 条 染 色体区段 25
**
Col
* ** * * **
1、4、8、10、11、13、15、18、19共9个 样品，只包含来自于亲本Col的染色体区段， 没有发生交换
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26
**
*
Ler
5、6、14共3个样品，只包含来自于亲本Ler的 染色体区段，也就是发生了两次交换
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1
在拟南芥的众多生态型中最常用的三种是 • Landsberg erecta(Ler) • Columbia(Col) • Wassilewskija(Ws)
• 其中Col生态型用于拟南芥的全基因组测序。
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2
Marker
SSLPs CAPs dCAPs InDel SNP
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3
• SSLP
= simple sequence length polymorphisms 简单序列长度多态性 又称 SSR= simple sequence repeats
比较产物长度
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4
• CAPs
= cleaved amplified polymorphic sequences Байду номын сангаас切扩增多态性
短根17
F2 短根个体
Col 单带
Ler单带
Col Ler 双带
• 因为F2代根据表型来筛选个体时，我们人工选 择的是短根表型，选择的个体为短根aa，即突 变位点不可能存在交换，交换率= 0
• 其他位点可能存在交换，利用带型差异判断交
换次数
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Ler
Col
wild type
假设： Aa 突变位点 有5个Marker
长于亲本Col中m4染色
体区段，在该差异位点
两 侧 设 计 引 物 经 PCR 扩
增 后 得 到 的 PCR 产 物 就
会有不同长度，电泳后
M4泳动速度慢，m4泳
动速度快，因此通过电
泳就可以分辨来自于两
个亲本的染色体区段
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注意后两种情 况反映的是来 自于两个配子 的染色体区段 的情况
包含来自于 两个亲本的 染色体片段