白酒大曲中微生物的分离鉴定(DOC)

白酒大曲中微生物的分离鉴定
目录
摘要 (1)
ABSTRACT (1)
第一章绪论 (2)
1.1引言 (2)
1.2中古传统的白酒文化 (2)
1.3中国白酒的品质 (2)
1.4中国白酒的类型 (2)
1.5白酒行业的发展和展望 (3)
1.6白酒大曲的制作工艺 (3)
1.7白酒的发酵剂-大曲 (4)
1.8大曲的类型 (4)
1.9大曲的类型 (4)
1.10大曲酿造对白酒的影响 (5)
1.11微生物对白酒大曲的影响 (5)
1.12本文研究的内容和意义 (6)
第二章材料与方法 (6)
2.1材料 (6)
2.1.1菌种来源 (6)
2.1.2培养基 (6)
2.1.3试剂 (6)
2.1.4仪器 (7)
2.2实验方法 (7)
2.2.1 菌株的分离和纯化 (7)
2.2.2 镜检和生理生化指标检验 (8)
2.2.3.1DNA的提取 (8)
2.2.3.2提取的DNA进行琼脂糖凝胶电泳检测 (9)
2.2.3.3提取的DNA进行PCR扩增 (10)
2.2.3.4 PCR扩增后的DNA进行琼脂糖凝胶电泳检测 (11)
2.2.4 16SrDNA序列鉴定 (11)
第三章结果与分析 (11)
3.1分离得到的菌株外观形态和生理生化指标鉴定 (11)
3.2 PCR扩增产物DNA测序结果和分析 (13)
第四章结论 (15)
致谢 (15)
参考文献 (16)
摘要
摘要：大曲，又称块曲或砖曲，以大麦、小麦、豌豆等为原料，经过粉碎，加水混捏，压成曲醅，形似砖块，大小不等，让自然界各种微生物在上面生长而制成，统称大曲。

在经过强烈蒸煮的白米中，移入曲霉的分生孢子，然后保温，米粒上即茂盛地生长出菌丝，此即酒曲。

在曲霉的淀粉酶的强力作用而糖化米的淀粉，因此，自古以来就把它和麦芽同时作为糖的原料，用来制造酒、甜酒和豆酱等。

用麦类代替米者称麦曲。

大曲是酿制大曲酒用的糖化发酵剂。

在制曲过程中依靠自然界各种微生物富集到用淀粉质原料制成曲坯上，经过扩大培养，形成各种有益的酿酒微生物菌糸和酶系，再经过风干、贮藏，即成为成品大曲。

大曲是微生物的大本营，也是酶的贮存库，国外在我国曲中分离出许多优良菌种，文献报到这些微生物主要是由原料带来的，原料上附着的微生物种类及数量，对大曲质量起到支配地位。

本研究从传统生物学和现代生物学两方面对大曲微生物的研究和检测进行阐述，以期为大曲微生物的研究提供思路，并进一步从微生物的角度指导大曲生产。

经典分类学和分子生物学方法的结合，对传统白酒微生物菌群的快速、准确认识目的性纯菌株的利用具有重要意义。

关键词：酒曲；微生物；鉴定；生理生化特性；菌种纯化；研究和检测
ABSTRACT
Abstract:Daqu, also called qu or brick, such as wheat, barley and pea as raw material, after crushing, add water, kneading, pressing into fermented grains, shaped like a brick, sizes, all kinds of microorganisms in natural world growth made above, a general designation of Daqu. After cooking the rice, strong in Aspergillus conidia, then heat preservation, namely on the grain grow abundantly hyphae, this is known as Jiuqu.
Amylase in aspergillus powerful role and saccharified rice starch, as a result, since time immemorial and malt as the raw material of sugar at the same time, it used to make wine, liqueur, bean paste and so on. Using wheat instead of rice said wheat qu. Daqu was brewed Daqu in saccharifying leaven. In the process of koji making various microbial enrichment to rely on nature made curved slab on the starch raw material, through expanding training,formed a variety of beneficial microbes bacteria si and enzyme system, after drying, storage, namely become finished product Daqu.
Daqu is the capital of the microbial and enzyme stores abroad in our country.The isolated a number of excellent strains in our country high temperature Daqu,Reports of these microorganisms is mainly composed of raw materials brought,Microbial species and quantity of material attached, to the dominance of Daqu quality.
The research and detection progress of microbes in Daqu was elaborated from two aspects including traditional biology and modern biology, which might provide new approaches to Daqu microbes research and further provide scientific guidance for Daqu production from the angle of microbiology. The combination of classical taxonomy and molecular biological methods was of great significance in rapid and accurate identification
of microbial community in traditional liquor and the use of pure strains.
Key words：starter; microbes; identification; physiological-biochemical characteristic;
Bacteria purification; research and detection
第一章绪论
1.1引言
以小麦等粮食为原料，在事宜的水分和条件下，微生物利用大曲胚作为培养基，经传统法人工控温，自然网罗，繁殖和培养具有糖化发酵作用的微生物制剂，这一操作过程在酿酒行业上被成为制曲工艺。

曲的主要功能除了作为酿酒的糖化剂外，麦曲内积累的微生物的代谢产物，能赋予大曲白酒以独特风味。

曲在酿酒中的重要作用，正如早在我国明代宋应星著的《天工开物》指出的那样：“无曲，即佳米珍黍则重造不成”。

所以说，大曲质量的好坏与优劣，直接关系到成品酒的质量。

而大曲中的微生物对与大曲发酵有着重大的意义。

1.2中古传统的白酒文化
中国是卓立世界的文明古国，是酒的故乡。

中华民族五千年历史长河中，酒和酒类文化一直占据着重要地位。

酒是一种特殊的食品，是属于物质的，但又同时融于人们的精神生活之中。

酒文化作为一种特殊的文化形式，在传统的中国文化中有其独特的地位。

在几千年的文明史中，酒几乎渗透到社会生活中的各个领域。

首先，中国是一个以农立国的国家，因此一切政治、经济活动都以农业发展为立足点。

而中国的酒，绝大多数是以粮食酿造的，酒紧紧依附于农业，成为农业经济的一部分。

粮食生产的丰歉是酒业兴衰的晴雨表，各朝代统治者根据粮食的收成情况，通过发布酒禁或开禁，来调节酒的生产，从而确保民食。

在一些局部地区，酒业的繁荣对当地社会生活水平的提高起到了积极作用。

酒，在人类文化的历史长河中，已不仅仅是一种客观的物质存在，而是一种文化象征，即酒神精神的象征。

在中国，酒神精神以道家哲学为源头。

庄周主张物我合一、天人合一、齐一生死。

庄周高唱绝对自由之歌，倡导“乘物而游”、“游乎四海之外”、“无何有之乡”。

庄子宁愿做自由的在烂泥塘里摇头摆尾的乌龟，而不做受人束缚的昂头阔步的千里马。

追求绝对自由、忘却生死利禄及荣辱，是中国酒神精神的精髓所在。

1.3中国白酒的品质
中国白酒之酒液清澈透明，质地纯净、无混浊，口味芳香浓郁、醇和柔绵、剌激性较强，饮后余香，回味悠久。

中国各地区均有生产，以四川、贵州、江苏、陕西、安徽、山西等地产品最为著名。

不同地区的名酒各有其突出的独特风格。

中国白酒是世界著名的蒸馏酒，据考证，是以发酵酒演化而来，虽然中国早已利用酒曲及酒药酿酒，但在蒸馏器具出现以前还只能酿造酒度较低的果酒或黄酒。

蒸馏器具出现以后，用酒曲及酒药酿出的酒再经过蒸馏，可以得到酒度较高的蒸馏酒，即中国白酒。

1.4中国白酒的类型
根据曲种不同，白酒分为“大曲酒”、“小曲酒”、“麸曲酒”、“混曲酒”等。

大曲块大，主要包含曲霉菌和酵母；小曲块小，主要包含毛霉菌、根霉菌和酵母。

霉菌将粮食中的淀粉分解成糖，酵母再将糖转化为酒精。

小曲发热量低，适于南方湿热气候。

中国大多名酒产于北方或夏季气候凉爽的川贵，多是大曲酒。

根据配方口味主要分为
四大香型，细致分来则有十二种之多。

1.5白酒行业的发展和展望
随着白酒行业竞争的不断加剧，大型白酒企业并购整合与资本运作日趋频繁，国内优秀的白酒企业愈来愈重视对行业市场的研究，特别是对企业发展环境和客户需求趋势变化的深入研究。

正因为如此，一大批国内优秀的白酒企业迅速崛起，逐渐成为白酒行业中的翘楚！
据《2013-2017年中国白酒行业产销需求与投资预测分析报告》统计，2012年1-8月白酒的产量、收入，白酒行业增速分别为20.1%、28.9%，相比其他行业以及相比白酒终端消费的表现，仍是一个让人惊喜的增速。

但纵向比较看，这一增速回落到了相当于2009年或2006年的水平。

不过，白酒行业的利润增速表现要好一些，仍维持在50%左右的高位，预计未来6个月会回落到30%附近。

预计2013年白酒行业的收入增速在15%-20%，利润增速在20%-30%。

白酒行业相对市场整体的PE估值(TTM)倍数为1.21倍，低于去年同期的1.56倍，同时低于3年历史均值10%，处于非常低的位置。

预计行业将继续深化兼并整合，出现比较大的调整。

1.6白酒大曲的制作工艺
图1.1 大曲曲块
图1.2 大曲粉末
制作方法 1．原料粉碎：把大麦60%、豌豆40%按比例配好，混匀粉碎，要求通
过20孔筛的细粉占20~30%。

2．踩曲：粉料加水拌匀，在曲模中踩成曲坯，由坯含水量为36~38%，要求踩的平整，饱满。

3．入房排列：曲室温度预先调节在15~20℃，地面铺上稻皮，把曲坯运入房中排列成行，间隔2~3厘米，每层上放置芦苇秆，再在上面放置一层曲块，共放三层。

4．长霉：将曲室封闭，温度会逐渐上升，一天后曲坯表面出现霉菌斑点，经36~37小时，品温升到38~39℃，应控制升温缓慢，使上霉良好。

5. 晾霉：曲坯品温升至38~39℃，打开门窗，揭去保温层，排潮降温，并把曲坯上下翻倒一次，拉开间距，以控制微生物生长，使曲坯表面干燥，固定成形，称为晾霉。

晾霉时，不应在室内产生对流风，防止曲皮干裂。

晾霉2~3天，每天翻曲一次，曲层分别由三层增到四层和五层。

6．起潮火：晾霉后，再封闭门窗进入潮火，品温上至36~38℃，进行翻曲，曲层由五层增到六层，并排列成“人”字形，每1~2天翻曲一次，昼夜门窗两封两启，品温两起两落，经4~5天曲坯38℃逐渐升到45~46℃，进入大火期，曲坯增到七层。

7．大火（高温）期：这时微生物菌丝由表面向里生长，水分和热量由里向外散失，可开启门窗调节品温，保持44~46%的高温7~8天，每天翻曲一次。

大火期结束，有50~70%的曲坯已成熟。

8．后火期：曲坯逐渐干燥，品温下降，由44~46℃降到32~33℃或更低，后火期3~5天。

9．养曲：后火期后，为使曲坯继续蒸发水分，品温控制在 28~30℃进行养曲。

10．出房：把曲块出房，堆成间距10厘米的曲堆。

1.7白酒的发酵剂-大曲
大曲:以小麦为原料，经粉碎后制成曲坯，让自然界微生物生长繁殖而成，称为大曲.。

大曲是酿制大曲酒用的糖化发酵剂。

在制曲过程中依靠自然界各种微生物富集到用淀粉质原料制成曲坯上，经过扩大培养，形成各种有益的酿酒微生物菌糸和酶系，再经过风干、贮藏，即成为成品大曲。

刚培养结束出房后的大曲，一般要经过三个有左右的贮存才能使用，每块大曲的重量在 2---3 公斤，含水量在 13 — 15% 左右。

1.8大曲的类型
现代大致将酒曲分为五大类，分别用于不同的酒。

它们是：麦曲，主要用于黄酒的酿造；小曲，主要用于黄酒和小曲白酒的酿造；红曲，主要用于红曲酒的酿造（红曲酒是黄酒的一个品种）；大曲，用于蒸馏酒的酿造。

麸曲，这是现代才发展起来的，用纯种霉菌接种以麸皮为原料的培养物。

可用于代替部分大曲或小曲。

目前麸曲法白酒是我国白酒生产的主要操作法之一。

其白酒产量占总产量的70%以上。

根据制曲过程中控制曲块最高品温的不同，一般把大曲分为高温曲和中温曲。

高温曲的最高制曲品温达 60 ℃以上，主要用于生产茅香型（俗称酱香型大曲酒）和泸香型（俗称浓香型）大曲酒。

中温曲的最高制曲品温一般不超过 50 ℃，它主要用来生产汾香型（俗称清香型）大曲酒，某些泸香型曲酒为了提高曲和酒的香味，从六十年代中期开始逐渐将制曲温度升高订为 55 — 60 ℃，成为偏高温曲。

为了提高酒的香气，除汾酒大曲和董酒麦曲外，绝大多数名、优酒厂都倾向于高温制曲。

1.9大曲的类型
1.配料粉碎：大曲以大麦、豌豆为原料，可保持酒质清香纯正、口味纯净。

大麦、豌豆按照一定比例配比，在不同的季节可作小幅调整。

配料前，原料要经过清洗除杂方可进行粉碎。

为了提高粉碎效果，第一次粉碎后的细粉，可经筛理后除去，粗粉要进行第二次粉碎。

曲料的粉碎度是制曲的关键技术，它直接影响到大曲的质量。

2.加水拌料：粉碎的曲料加水拌料又称和面，要使曲面和水充分接触并搅拌均匀而不黏。

曲面和水按照一定比例配比，即 2 kg 曲面加 1 kg 水，和好的曲料以手捏成团黏手、不流水滴为准，一定做到无生面、松散、软硬均匀。

3.踩曲：踩曲是白酒生产的一项传统工艺，以前是用脚踩成型，现在改用机器，
提高了生产效率。

踩制好的曲醅的标准是：曲块压制软硬、厚薄平整，四角饱满，四面光滑。

每块湿曲重量为 3.25~3.5 kg，形状为长方体，规格为270×170×55 mm，曲坯水分为 40%左右。

4.入房培养：大曲主要在曲房中培育。

曲房为土木建筑的平房，每房可容曲坯3000~4000块。

四周墙上建有整齐和易于启闭的门窗，屋顶设有通风气孔。

从曲块入房到出房要经一个月左右。

出房制成的曲块每个重 1.8~1.9 kg，长 26~27 cm，宽16~17 cm，高 4.8~
5.8 cm。

大曲现在共有清茬、高温、红心 3 种，生产的过程基本相同，主要有卧曲、上霉、晾霉、起潮火、大火、后火、养曲、贮曲等阶段，区别在于培曲阶段中使用的“火”的情况不一样，对空气的潮、湿度要求不一样。

曲坯入房后，按工艺要求控制温度发酵。

传统生产的曲房温度，全靠人工感觉控制，且在同一房内，清茬、红心、高温 3种大曲混杂，质量极不稳定。

20 世纪 50年代，开始运用温度计、湿度计等仪器检测，曲坯发酵也逐步由混杂型多花色化过渡到单一型单花色化。

后又进行多次技术改革：1954 年，清茬曲单独培养法试验成功；1964 年 1 月，高温曲试制成功；1964 年 6 月，在晋源食品厂技师吴效忠的指导下，生产出红心曲。

清茬曲、红心曲、高温曲的培养都要经过入房排列、上霉、晾霉、潮火、干火、后火等几个阶段。

不同的曲种在各个培育阶段，对温度、湿度都有不同的要求、不同的工艺、不同的技术标准和操作规范。

制曲的季节性要求较强，过去多在春、夏两季进行，从清明节到农历 10 月间为宜，伏曲尤佳。

从 1954 年开始，制曲工艺实行人工调节温度，使传统的大曲由季节性生产扩展为全年性生产。

清茬曲的最高升温为 45～46 ℃（品温），制曲周期 28 天，发酵比较平稳；高温曲的最高升温为 46～48 ℃（品温），此曲发酵正常，香味较好；红心曲品温超过46 ℃时，应经常开小窗控制，一般培养期为 23天，用它发酵香气较好。

成曲必须达到水分 10％~14％、淀粉40％~45％、还原糖 0.34％~0.44％、酸度0.25~0.5、糖化力 70~85 的质量标准。

制曲工人的工作主要是翻曲和看曲，昼夜要勤于管理、善于管理，这样才能生产出优质的大曲。

5.贮曲：出房评定后的各种大曲，按品种分别贮存在晾曲棚内，在通风的条件下自然干燥。

经贮存 3～6 个月后，水分、酸度、酶活性等趋于稳定，才可投入酿酒使用。

贮存的曲块排成人字形交叉，跺高以 13 层为标准，曲块间要有一定间隔，以利通风，防止在养曲中返潮、起火、生长黑霉。

3 种大曲要分别存放，标明日期，酿酒时要按照 3种大曲的比例混合粉碎。

1.10大曲酿造对白酒的影响
虽然中国人民与曲蘖打了几千年的交道，知道酿酒一定要加入酒曲，但一直不知道曲蘖的本质所在。

现代科学才解开其中的奥秘。

酿酒加曲，是因为酒曲上生长有大量的微生物，还有微生物所分泌的酶（淀粉酶、糖化酶和蛋白酶等），酶具有生物催化作用，可以加速将谷物中的淀粉，蛋白质等转变成糖、氨基酸。

糖分在酵母菌的酶的作用下，分解成乙醇，即酒精。

蘖也含有许多这样的酶，具有糖化作用。

可以将蘖本身中的淀粉转变成糖分，在酵母菌的作用下再转变成乙醇。

同时, 酒曲本身含有淀粉和蛋白质等，也是酿酒原料。

酒曲酿造是我国优势传统发酵食品白酒的酿造特征和精华所在, 酒曲被西方学者誉为中国的第五大发明。

大曲以小麦等谷物为原料, 进行固态生料发酵, 大曲作为白酒生产中微生物及酶的主要来源,其质量直接关系到酒的出
酒率及酒质。

“曲是酒之骨”，酒曲的好坏直接影响着酒的产量和质量。

1.11微生物对白酒大曲的影响
由于制曲工艺的不同, 不同工艺大曲在微生物群落结构上存在一定差异性, 并直接影响酒醅发酵菌系、酶系和物系组成。

一般认为, 利用中温曲酿造出的酒为浓香型
白酒, 高温曲则酿造出酱香型白酒。

中国白酒是世界上为数不多的以细菌为主要发酵剂的发酵食品, 无论大曲培养还
是酿酒发酵都离不开细菌, 细菌为发酵产香的主要动力。

茅台成品大曲中90%以上微生物为细菌, 被定义为细菌曲,且茅台大曲中细菌绝大多数为嗜热芽孢杆菌[6]。

梭状芽孢杆菌为浓香型白酒发酵过程中主体香己酸乙酯前体己酸的产生菌, 而乳酸菌等细菌则
发酵产生乳酸及各种氨基酸, 为酯化提供前体。

大曲的生产是靠传统工艺自然接种,它是富集、培养有益微生物和其代谢产物的载体。

大曲是通过网罗自然界中的各种微生
物在其自身上生长而制成的, 是大曲酒生产中的糖化发酵剂, 因此大曲中的微生物类
群极为丰富,是多种微生物的混合体系，主要包括霉菌、细菌和酵母菌。

1.12本文研究的内容和意义
本研究利用传统的分离培养方法和分子生物学方法相结合，对高温大曲中的微生物进行了分离定。

研究发现，高温曲是一种高温细菌酒曲[1]，其发酵温度可高达 65 ℃[2]
，酒曲中以芽孢杆菌最多，霉菌含量很少，酵母菌含量也很少[3]。

这些微生物在育种、酿酒、酶制剂、乳酸生产等方面具有重要作用，因此研究酒曲中的微生物具有重
要意义。

第二章材料与方法
2.1材料
2.1.1菌种来源：
传统酱香型白酒高温大曲
2.1.2培养基：
（1）细菌采用LB培养基：1000mL蒸馏水水中加入胰蛋白胨10克，酵母粉5克，氯化钠10克，加水至1L并调pH值至7.0后高温灭菌。

如需要制成固态培养基，在调pH值后加入1.5%（质量体积比，即每升培养基中加入15克）的琼脂再121℃灭菌20min。

霉菌采用察氏培养基：1000mL蒸馏水中加入硝酸钠3g，磷酸氢二钾 1g硫酸(MgSO4·7H2O) 0.5g氯化钾0.5g硫酸亚铁0.01g蔗糖30g琼脂20g加热溶解，分装后121℃灭菌20min。

（2）富集培养用PDA培养基：马铃薯 200克葡萄糖 20克琼脂 15~20克自来水 1000
毫升，自然PH，其做法是先洗净去皮,再称取200g马铃薯切成小块，加水煮烂（煮沸20~30分钟，能被玻璃棒戳破即可），用八层纱布过滤，加热，再据实际实验需要加琼脂，继续加热搅拌混匀，待琼脂溶解完后，加入葡萄糖，搅拌均匀，稍冷却后再补足水分至1000毫升，分装试管或者锥形瓶，加塞、包扎，（121℃）灭菌20分钟左右后取出试管
摆斜面或者摇匀，冷却后贮存备用[8]。

（3）筛选时用到淀粉培养基：牛肉膏0.5g，蛋白胨1g，氯化钠0.5g，可溶性淀粉0.2g 水100mL，pH 7.0～7.2，琼脂2g，，121℃灭菌20min后倒平板。

注：本实验中灭菌采用高压蒸汽灭菌锅
2.1.3试剂：
葡萄糖、琼脂、蛋白胨、NaCl、牛肉膏、可溶性淀粉、蒸馏水、碘液、阿魏酸乙酯、酚、氯仿、异戊醇、异丙醇、乙醇，双蒸水、溴酚蓝、琼脂糖、酒精、双蒸水、
PCR试剂盒，等。

2.1.4仪器：
表2.1 仪器及厂商
名称生产厂家
电泳仪北京六一仪器厂
微量高速离心机长沙平凡仪器仪表有限公司
旋涡混合器江苏海门市麒麟医用仪器厂
手提式压力蒸汽消毒器北京市永光明医疗仪器厂
PCR扩增仪杭州博日科技有限公司
紫外凝胶成像仪美国Bio-rad公司
电泳仪北京市六一仪器厂
超净工作台济南普朗特生物科技有限公司
高压灭菌锅北京光明医疗仪器厂
微量移液器 Finnpipette
微波炉格兰仕微波炉电器有限公司
恒温摇床江苏金坛市全城国胜实验仪器厂
恒温培养箱北京光明医疗仪器厂
冰箱容声电器股份有限公司
数显恒温水浴锅江苏金坛市全城国胜实验仪器厂
精密PH试纸天津市金达化学试剂有限公司
电炉上海日用电炉厂
2.2实验方法
概述：传统的微生物鉴定方法，主要指利用传统方法对微生物进行分离、培养，显微镜下观察微生物细胞形态及培养基上的菌落形态，微生物利用碳源、N 源、无机盐等物质的能力，微生物对氧的需求，以及微生物重要的生理生化指标特征等，对微
生物进行分析和鉴定[9]。

建国以来，我国科研工作者一直进行着对大曲微生物区系的研究，特别是20 世纪80 年代后期以来，随着对传统固态发酵白酒的再认识，大曲微生物的研究逐渐进入高潮。

酿酒科技工作者通过对大曲微生物群落的不断探索，先后分离出多种酿酒功能微生物[5]，对于大曲酿酒具有重要指导意义。

2.2.1 菌株的分离和纯化
取1g大曲，在超净工作台上用灭过菌的研钵研碎后加入到50ml的LB液体培养基中，放在摇床上，180rpm,30℃震荡培养两天。

两天后取菌悬液分别稀释10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6 10-7 这七个梯度，然后涂布平板，每个梯度涂布两个平板。

取0.1g大曲按照上述方法加入液体PDA培养基，重复上述步骤。

选取能分离出单菌落的平板，挑取菌落形态和颜色不同的菌落，纯化两到三次，保存备用。

图2.1稀释涂布平板图
图2.2单菌落纯化图
2.2.2 镜检和生理生化指标检验
把分离到的各个菌株放在显微镜下镜检，用革兰氏染色和芽孢染色法对分离到的菌株进行观察，然后用试管对各菌株进行一些生理生化指标鉴定。

方法如下：革兰氏染色法一般包括初染、媒染、脱色、复染等四个步骤，具体操作方法是：（1）载玻片固定。

在无菌操作条件下，用接种环挑取少量细菌于干净的载玻片上涂布均匀，在火焰上加热以杀死菌种并使其粘附固定。

（2）草酸铵结晶紫染1分钟。

（3）自来水冲洗，去掉浮色。

（4) 用碘-碘化钾溶液媒染1分钟，倾去多余溶液。

（5）用中性脱色剂如乙醇（95%）或丙酮酸脱色30秒，革兰氏阳性菌不被褪色而呈紫色，革兰氏阴性菌被褪色而呈无色。

酒精脱色为整个流程最关键的一步。

（6）用蕃红染液或者沙黄复染30秒，革兰氏阳性菌仍呈紫色，革兰氏阴性菌则呈现红色。

革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌即被区别开
2.2.
3.1DNA的提取
试剂1：细菌染色体提取液（20mmol/L Tris-HCl(Ph7.9),10 mmol/L MgCl2，DTT 1mmol/L ,EDTA 1 mmol/L 5%甘油（v/v） 0.3 mol/L (NH4)2SO4）
试剂2：饱和酚：氯仿：异戊醇=25：24：1
试剂3：异丙醇，无水乙醇，3 mol/L醋酸钠（pH5.2），玻璃珠
步骤：1.活化菌株，接种1%，于LB液体培养基中，30℃，200r/min摇床培养18-20h 2.取1.4ml菌悬液于1.5ml epp管中，8000r/min离心3min，弃掉上清液，用无菌水洗涤一次再离心。

3.弃上清，出去水后加入200ul细菌染色体提取液，混匀移到其中有0.3g微小玻璃珠的1.5ml epp管中，再加入200ul饱和酚：氯仿：异戊醇，在旋窝混匀器上震荡
3-5min
4.加入200ul TE缓冲液，轻轻混匀，静置2-3min，4℃下12000r/min离心10min。

将上层水相轻轻移到另一干净的epp管中，并作上标记。

（若抽提不干净，再重复一次）
5.向上清中加入1/10体积的醋酸钠。

并加入等体积的异丙醇，-20℃下沉淀15min，然后12000r/min离心10min。

6.弃掉上清液，用75%的乙醇沉淀一到两次，离心，弃掉乙醇，将epp管倒扣在一无菌滤纸上，晾至半透明，-20℃下保存备用。

2.2.
3.2提取的DNA进行琼脂糖凝胶电泳检测
葡聚糖凝胶电泳体系：
6×loading buffer 1ul+样品 5ul（滴到干净一次性手套上，枪头混匀）
Marker: λDNA（PstI切）Marker 3ul
制胶：用量筒量取15ml缓冲液于三角瓶中，向其中加入0.12g葡聚糖，封口后放入微波炉加热1min后取出，室温冷却后倒胶，放入冰箱冷却。

冷却后取下梳子，放入电泳槽中。

按照电泳体系混合样品与loading buffer后加入点样孔。

将marker加入到紧邻点样孔中，接通电源开始电泳。

电泳40min左右结束。

拍照：带上三层一次性塑料手套，取出胶放入EB液（EB液有致癌危险）中染色15min，取出放入蒸馏水中漂洗，取出放入凝胶拍照系统中，打开电源和紫外线拍照，观察电泳出的DNA条带
图2.3提取的到的DNA电泳图
泳道1-10是所提相应菌种的DNA，泳道11是Marker：λDNA（PstI切）。